分枝狀肽小核酸分子輸遞系統(tǒng)的設計、制備及其細菌內遞藥特性的研究.pdf

1、目的：
　　耐藥細菌感染已成為臨床抗感染治療中極為棘手的問題，是造成重癥感染死亡的首要原因，尤其是多重耐藥、全耐藥的超級細菌感染，臨床可選的抗菌藥物十分有限。更令人擔憂的是，耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠遠超過了新抗菌藥物的研發(fā)速度。因此，尋找和研制對抗耐藥細菌的新策略和新藥物，已成為當今世界各國醫(yī)學科學家當務之急的研究課題。
　　抗菌藥物的經(jīng)典研究思路是以細菌蛋白為靶點，而反義抗菌策略則是以細菌內致病、耐藥、生存等關鍵基因為靶點

2、，采用反義小核酸分子阻斷這些基因的表達，從而達到抑制或者殺滅細菌的作用。與經(jīng)典的抗菌藥物相比，反義抗菌分子具有靶標基因明確、藥物分子設計容易、特異性強、不易誘導耐藥、能夠快速規(guī)?；苽洹⒀邪l(fā)周期短等優(yōu)點。因而反義抗菌策略被認為是抗耐藥菌感染最有希望的突破口。采用反義抗菌策略，我們實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)了多個細菌靶標基因，篩選出多個反義抗菌分子，并在離體和感染動物模型上證實了這些反義抗菌分子能夠有效阻斷細菌基因，從達起到逆轉細菌耐藥性、抑

3、制或殺滅細菌的作用。然而，反義核酸是一類親水性強，分子量大，荷負電荷的分子，祼的反義核酸分子很難穿透細菌胞膜進入細菌細胞內，這已成為制約反義抗菌藥物進一步開發(fā)研究的瓶頸。因此，研制高效向細菌內遞送小核酸藥物的遞送系統(tǒng)，是反義抗菌藥物研究領域重要的課題，也是實現(xiàn)反義抗菌藥物向臨床應用過渡必須突破的難點。
　　理想的反義抗菌分子遞送載體應當能安全高效的將反義抗菌分子遞送至細菌內，使其選擇性阻斷細菌靶基因的表達而發(fā)揮抗菌作用。已有文獻研

4、究表明，透膜肽能夠通過共價偶聯(lián)的方式將小核酸分子遞送至細菌內發(fā)揮抗菌作用，但這種策略受載藥量低、連接臂設計及合成困難等因素的限制而難以推廣。有文獻報道，與線性結構的多肽相比，分枝狀多肽因具有廣闊的分子內腔結構，更有利于小核酸分子的包裹和遞送。然而分枝狀多肽能否與反義抗菌分子以非共價方式形成納米粒從而實現(xiàn)細菌內遞藥，目前尚無研究報道?；卮鹕鲜鰡栴}至少應該明確：①哪些因素影響分枝狀多肽/小核酸藥物納米粒的形成？②分枝狀多肽中哪些因素與納米粒

5、在細菌遞送效率直接相關？③細菌細胞和哺乳動物細胞對納米粒的攝取機制有何不同？④不同的細菌如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或者敏感菌與耐藥菌對納米粒的攝取特點是否不同？本課題針對上述未知領域，以含有四個末端分支的多肽為基本結構，以亮氨酸-色氨酸-精氨酸為基本重復序列，考慮電荷數(shù)目及分布、親水與疏水、羥基氨基酸、組氨酸及脂質輔助成分等影響因素，設計七條分支狀多肽（Dendritic Poly-peptide, DPP），以第一代反義核酸分子硫代

6、反義寡核苷酸（PS-ODN）為模型藥物，系統(tǒng)研究分枝狀肽-反義核酸分子納米粒（ODN/DPP納米粒）的制備及其影響因素，深入探討納米粒細菌內遞藥特性及可能的遞送機制，為反義抗菌技術的發(fā)展提供新的依據(jù)。
　　方法：
　　1. DPP的設計與合成
　　我們共設計了七條分枝狀多肽，命名為 DPP1-7。重點考察以下因素對納米粒制備和細菌內遞藥的影響：①親水性與兩親性：DPP1，DPP4，DPP5和DPP6為親水性 DPP，而

7、 DPP2，DPP3，DPP7為兩親性 DPP；②電荷分布：在 DPP1和DPP6分枝中，正電荷分布分別呈兩端分布和平均分布，在 DPP2疏水分枝和親水分枝中，電荷分布呈一疏一密，而DPP3中電荷集中分布在親水枝。③羥基氨基酸：DPP1和DPP6中含有亮氨酸和色氨酸，而在DPP4和DPP5中用含有羥基的絲氨酸和蘇氨酸代替。④組氨酸：DPP7中用組氨酸來替換 DPP3中親水端中的賴氨酸。DPP采用十二通道半自動多肽合成儀合成，并通過LC-

8、3000高效液相色譜儀純化， API-150EX質譜儀測定DPP分子量。
　　2. ODN/DPP納米粒的制備與表征
　　將DPP與PS-ODN按不同氮磷比充分混勻，在37°C孵育，使DPP與PS-ODN通過靜電作用形成ODN/DPP納米粒。然后用凝膠電泳檢測，篩選出最佳N: P比，按最佳 N: P比制備納米粒并表征。表征主要分三部分，一是用透射電鏡觀察ODN/DPP納米粒的形態(tài)，二是用DLS測量納米粒粒徑和zeta電勢，三

9、是用熒光分光光度法定量ODN/DPP的包封率。
　　3. ODN/DPP納米粒形成的影響因素及穩(wěn)定性
　　用不同濃度的磷酸鹽緩沖液和不同pH值的磷酸鹽緩沖液為溶劑制備ODN/DPP納米粒，并比較不同條件下所制備的納米粒粒徑；用圓二色譜法測量不同溶劑中DPP的二級結構，探索溶劑影響納米粒形成的原因；其次采用兩步法制備ODN/DPP/DOTAP納米粒，并通過DLS比較與ODN/DPP納米粒粒徑的大小，評價脂質輔助劑 DOTAP對

10、納米粒粒徑的影響。將制備好的納米粒存儲于4°C，每隔一周用DLS測定其粒徑變化，連續(xù)測四周，以評價其時間穩(wěn)定性。
　　4. ODN/DPP納米粒對PS-ODN的遞送效率及特征
　　實驗菌株選用產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌（ESBLs-EC）、敏感型大腸埃希菌（EC）、產超廣譜內β-酰胺酶肺炎克雷伯桿菌（ESBLs-KP）、鼠傷寒沙門桿菌（ST）四株革蘭氏陰性菌，和金黃色葡萄球菌（SA）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）

11、、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（ MRSE）、糞腸球菌（ EF）四株革蘭氏陽性菌。用FITC-labeled PS-ODN與DPP制備納米粒，與細菌在37°C避光共孵育一定時間，然后用流式細胞儀檢測細菌陽性率，評價不同ODN/DPP納米粒在不同細菌內的遞送能力和遞送速率。
　　5. ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒對細菌靶基因表達和細菌生長的抑制
　　實驗菌株選用ESBLs-EC。采用RT-PCR法檢測anti-r

12、poD ODN/DPP和anti-rpoD ODN/DPP/DOTAP納米粒對ESBLs-EC靶基因rpoD表達的影響，通過生長曲線測定 ODN/DPP/DOTAP納米粒對細菌生長的抑制，確定 anti-rpoD ODN/DPP和anti-rpoD ODN/DPP/DOTAP納米粒能否將PS-ODN有效的遞送進細菌內并發(fā)揮抗菌作用。
　　6. ODN/DPP/DOTAP納米粒組分功能分析和納米粒的細菌攝取機制探討
　　制備

13、FITC-labeled ODN/DPP2納米粒、ODN/DPP2/DOTAP納米粒和ODN/DOTAP納米粒，并通過流式細胞儀分別檢測納米粒在 ESBLS-EC和 MRSA內的遞送效率，結合RT-PCR和生長曲線的結果，分析納米粒中各組分的功能；將FITC-labeled ODN/DPP納米粒與細菌分別在4°C和37°C共孵育后用流式細胞儀檢測細菌陽性率，探索ODN/DPP納米粒的細菌內遞送是否為能量依賴性過程；將細菌用哺乳細胞內吞抑

14、制劑處理后，再與FITC-labeled ODN/DPP納米粒避光共孵育，并檢測細菌陽性率，以探索ODN/DPP納米粒的細菌內攝取機制。
　　結果：
　　1. ODN/DPP納米粒制備及形態(tài)表征
　　通過凝膠電泳，得到ODN/DPP納米粒制備的最佳氮磷比為8；TEM觀察結果顯示氮磷比為8時，ODN/DPP納米粒呈球形，粒徑約45~80 nm；DLS測量結果顯示，ODN/DPP納米粒zeta電勢<5 mV，PDI<0.3

15、，分布均一；含有羥基氨基酸的DPP4和DPP5不能與PS-ODN形成穩(wěn)定納米粒；親水性與兩親性、電荷分布和組氨酸都對ODN/DPP納米粒形成沒有影響；ODN/DPP納米粒對PS-ODN的包封率在80％以上。
　　2. ODN/DPP納米粒粒徑的影響因素與穩(wěn)定性
　　溶劑中磷酸鹽濃度對ODN/DPP納米粒的制備具有顯著影響，溶劑中離子濃度的升高會導致納米粒粒徑急劇增大；除ODN/DPP2以外，溶劑pH值對的ODN/DPP納米粒

16、的形成過程沒有明顯影響；圓二色譜法分析結果顯示，當鹽溶液濃度超過20 mM時，DPP的二級結構發(fā)生明顯變化；在pH為5.5的酸性溶劑中，DPP2的二級結構也發(fā)生變化。輔助劑DOTAP對納米粒粒徑?jīng)]有影響；穩(wěn)定性研究結果顯示，所制備的納米粒在4°C可穩(wěn)定保存2周。
　　3. ODN/DPP納米粒遞送效率及特征
　　與親水性DPP1，DPP4，DPP5和DPP6所制備的納米粒共孵育后，待測菌陽性率不足50%，而與兩親性DPP2，

17、DPP3和DPP7納米粒共孵育后，細菌陽性率多在90%以上；兩親性ODN/DPP納米粒在ESBLS-EC內的遞送過程很快，孵育5至10 min細菌陽性率即達到最高，但在 MRSA菌株上，其遞送過程較慢，孵育30 min后才達到最高細菌陽性率。
　　4. ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒對靶基因表達和細菌生長的抑制
　　1μM的兩親性anti-rpoD ODN/DPP和ODN/DPP/DOTAP納米粒都能有效抑

18、制ESBLS-EC rpoD基因的表達，并能有效延遲細菌的生長，而且 ODN/DPP/DOTAP納米粒的效率更高。
　　5. ODN/DPP/DOTAP納米粒組分功能分析和納米粒的透膜機制探討
　　流式細胞儀檢測結果提示，ODN/DPP2/DOTAP和ODN/DPP2納米粒的細菌內遞送效率沒有顯著性差異，而ODN/DOTAP不能有效進入菌內，說明納米粒中DPP主要發(fā)揮透膜作用，而DOTAP并不影響透膜過程；細菌與ODN/DP

19、P納米粒在不同溫度孵育后，陽性率沒有顯著差別，提示ODN/DPP納米粒菌內遞送過程是非能量依賴的；網(wǎng)格蛋白介導胞吞抑制劑氯丙嗪能夠抑制ODN/DPP納米粒在革蘭氏陽性菌內的遞送，而巨胞飲介導內吞抑制劑阿米洛利和小窩蛋白介導胞吞抑制劑染料木素則無影響；三種胞吞抑制劑對ODN/DPP納米粒在革蘭氏陰性菌上內的遞送效率無影響。
　　結論：
　　1.氮磷比為8時，可制備得到包封率高、穩(wěn)定性好，粒徑為45~80 nm的球形ODN/DP

20、P納米粒，其制備影響因素研究表明：溶劑鹽離子濃度能顯著增高納米粒粒徑，是影響ODN/DPP納米粒制備的關鍵因素。
　　2.兩親性DPP2，DPP3，DPP7制備的納米粒在實驗所測八株菌中均有良好的遞送效率，在DOTAP存在條件下，能顯著抑制細菌靶基因的表達和延遲細菌的生長。
　　3.革蘭氏陰性菌和陽性菌對兩親性ODN/DPP納米粒存在不同的攝取機制。
　　4.證實脂質DOTAP能顯著提高兩親性ODN/DPP納米對靶基因