四種高致病性病毒候選診斷抗原的制備及鑒定.pdf

1、目的：蜱傳腦炎病毒（Tick-borne Encephalitis Virus，TBEV）、基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus，CHIKV）、黃熱病毒（Yellow Fever Virus，YFV）與埃博拉（Ebola Virus）病毒均是高致病性烈性病毒，對于這些病毒的實驗研究需要在高等級的生物安全實驗室中進(jìn)行，增加了實驗的成本和難度。為了能夠降低實驗感染風(fēng)險，能在低等級生物安全實驗室完成相關(guān)病毒的檢測與鑒定，本實驗根據(jù)

2、4種高致病性病毒的分子結(jié)構(gòu)特點，分別選取了適合用作診斷抗原的基因，用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原，為這4種高致病性烈性病毒的血清學(xué)特異性診斷提供了候選抗原。
　　方法：1.將TBEV的prM-E基因連接到pNLF1-secN質(zhì)粒中構(gòu)建真核表達(dá)載體pNLF-prM-E，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中，與Nano Glo Luciferase熒光素酶蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，并通過測定細(xì)胞上清液的熒光素酶值鑒定蛋白的表達(dá)情況；間接免疫熒光試驗鑒定

3、重組蛋白與 TBEV特異性抗體的結(jié)合情況；熒光素酶免疫共沉淀（Luciferase Immunoprecipitation System，LIPS）方法對20份TBEV病人陽性血清及3份正常人血清進(jìn)行檢測。2.通過原核表達(dá)的方法將CHIKV的E1、E2基因，YFV的E基因和EbolaV的NP基因重組表達(dá)，并通過鎳柱親和純化重組蛋白；將CHIKV的重組蛋白作為檢測抗原，通過ELISA方法對基孔恢復(fù)期病人感染血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測；以Y

4、FV的重組蛋白作為檢測抗原對實驗室已制備的 YFV免疫鼠血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測；將EbolaV的重組蛋白NP作為免疫原免疫小鼠，并以NP蛋白作為檢測抗原對免疫小鼠血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：1.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pNLF-prM-E的細(xì)胞上清中可檢測到熒光素酶的高表達(dá)；間接免疫熒光試驗檢測到用pNLF-prM-E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與TBEV抗體特異結(jié)合；LIPS方法以重組蛋白prM-E為檢測抗原從20份TBEV患者血清中

5、檢測出19份陽性結(jié)果，3份正常人血清均為陰性。
　　2.成功表達(dá)并純化出CHIKV的CHIKV E1-1、CHIKVE2-1與CHIKV E2-2重組蛋白，YFV的YFV E1-1、YFV E1-2與YFV E2-1重組蛋白，以及EbaloV的NP重組蛋白；未能成功表達(dá)CHIKV E1-2與YFV E2-2重組蛋白；CHIKV E1-1、CHIKV E2-1與CHIKV E2-2三種重組抗原作均能與基孔恢復(fù)期病人感染血清特異性結(jié)合

6、，并與同屬病毒免疫的對照血清無交叉反應(yīng)；YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-1三種重組抗原均能與YF免疫鼠血清中的抗體良好結(jié)合，雖與DEN3型患者血清有一定的交叉反應(yīng)，但與陽性鼠血清相比可以辨別區(qū)分；成功制備了EbolaV免疫小鼠血清，血清中的抗體能與重組抗原NP特異結(jié)合，并與其它對照血清無交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pNLF-prM-E，并在COS7細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)prM-E蛋白具有良好的抗原性