中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）是危重病人常見的一組并發(fā)癥。在發(fā)展中國家及發(fā)達(dá)國家都非常普遍，因其具有高的發(fā)病率及死亡率，因此危害極大[1]。急性腎損傷通常發(fā)生在各種大手術(shù)后及危重病人中。據(jù)報(bào)道稱有36％的ICU病人并發(fā)AKI。盡管嘗試了各種方法來預(yù)防、緩解AKI的發(fā)生，但效果仍不理想，死亡率高、住院天數(shù)延長、治療費(fèi)用增加這些問題依舊突出[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，偶然發(fā)現(xiàn)可以早期在尿中快速檢測

2、到中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL），因此引起了人們研究將NGAL作為AKI病人非侵入性指標(biāo)的興趣。血、尿NGAL水平與AKI病人血肌酐水平、腎活檢結(jié)果相關(guān)。使用免疫組化技術(shù)觀察到AKI病人在皮質(zhì)腎小管區(qū)有大量NGAL表達(dá)。隨后，越來越多的臨床試驗(yàn)也證實(shí)了NGAL可作為診斷各臨床背景下AKI發(fā)生的一個(gè)早期指標(biāo)[3]。然而除了將其作為早期診斷AKI的生物指標(biāo)外，越來越多的證據(jù)表明NGAL在缺血再灌注腎損傷過程中也發(fā)揮著一定的保護(hù)

3、作用。國外學(xué)者通過建立小鼠缺血再灌注損傷
　?。↖schemia/Reperfusion，I/R）模型，檢測外源性NGAL蛋白對I/R腎損傷的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予外源性NGAL蛋白治療組的小鼠較模型組腎功能得到了明顯的改善，腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。凋亡是急性腎損傷發(fā)生后腎小管上皮細(xì)胞重要的死亡形式。目前，關(guān)于NGAL蛋白參與I/R腎損傷凋亡過程的機(jī)制研究較少，本課題擬通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，觀察外源性NGAL蛋白對I/

4、R腎損傷的抗凋亡保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　研究目的:
　　通過建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型觀察外源性中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）對大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　研究方法:
　　首先建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型：將一側(cè)腎蒂結(jié)扎并予以切除，之后用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉對側(cè)腎蒂45 min。將30只成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機(jī)分組原則分為三組，每組各10只，分別為對照組，缺血再灌

5、注組和缺血再灌注給藥組。術(shù)前藥物準(zhǔn)備：用2ml滅菌蒸餾水溶解50μg重組大鼠NGAL蛋白，分四次（0.5ml/次）經(jīng)缺血再灌注給藥組大鼠尾靜脈注入，即缺血前30 min、缺血中及缺血后30、60 min，對照組與缺血再灌注組于相同時(shí)間點(diǎn)給予相同劑量（0.5ml）的0.9%氯化鈉注射液。全自動(dòng)生化分析儀檢測再灌注24 h后大鼠的血清肌酐
　?。⊿cr）和血尿素氮（Bun）水平；蘇木精-伊紅（HE）染色光鏡下觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變；TU

6、NEL染色檢測各組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡情況；免疫組織化學(xué)染色及Western blot技術(shù)檢測活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CC3）及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction）技術(shù)檢測各組大鼠Bax mRNA水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　?。?）腎功能：再灌注24 h后，缺血再灌注組的Scr水平為（121.857±17.15

7、1）μmol/L，顯著高于對照組及缺血再灌注給藥組的（24.000±3.829）及（63.400±11.908）μmol/L（P值均　?。?

8、）HE染色：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給予外源性NGAL蛋白治療組的腎臟損傷情況較缺血再灌注組顯著減輕，對照組腎臟結(jié)構(gòu)清晰。
　　（3）TUNEL染色：TUNEL染色陽性細(xì)胞主要見于腎小管上皮細(xì)胞。對照組及缺血再灌注給藥組的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為1.800±0.837個(gè)/高倍視野及7.800±1.924個(gè)/高倍視野，均顯著低于缺血再灌注組的15.400±3.049個(gè)/高倍視野（P值均<0.05）。
　?。?）免疫組織化學(xué)染色與圖像半定量分析

9、：對照組的CC3和Bax蛋白陽性表達(dá)率分別為（0.608±0.148）%、（3.716±0.482）%，缺血再灌注給藥組的CC3和Bax蛋白陽性表達(dá)率分別為（3.171±0.321）%、（7.440±1.640）%，均顯著低于缺血再灌注組的（7.291±1.059）%、（15.456±1.955）%（P值均<0.05）。
　?。?）Western Blot：對照組的CC3及Bax的蛋白表達(dá)分別為0.104±0.029及0.155±

10、0.027,；缺血再灌注給藥組的CC3及Bax蛋白表達(dá)分別為0.284±0.066及0.346±0.055，均顯著低于缺血再灌注組，0.409±0.073及0.443±0.041（P值均<0.05）
　?。?）Real-time PCR：缺血再灌注給藥組的Bax mRNA表達(dá)明顯低于缺血再灌注組（1.423±0.187 VS2.550±0.217，P值<0.05），但兩者均高于對照組的Bax mRNA表達(dá)（1.000±0.000，