N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1及其對(duì)伴放線放線桿菌生物膜作用的研究.pdf

1、生物膜(biofilm)是由細(xì)菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。一旦形成生物膜，細(xì)菌將具有極強(qiáng)的抗生素耐藥性(比浮游細(xì)菌高100～1000倍)和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的能力。生物膜無處不在，在很多方面給人類生活帶來嚴(yán)重的影響。根據(jù)美國(guó)NIH的調(diào)查公告，80％以上的細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān)。由于傳統(tǒng)的抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物膜幾乎沒有作用，因此，如何防治細(xì)菌生物膜已成為人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。 牙菌斑生物膜是牙周病的

2、始動(dòng)因素，在牙茵斑生物膜的刺激下，牙周組織細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在牙槽骨吸收及牙周軟組織破壞的過程中發(fā)揮著重要作用。然而，目前絕大多數(shù)研究集中在浮游細(xì)菌對(duì)牙周組織細(xì)胞毒性的研究，而關(guān)于細(xì)菌生物膜與牙周病的研究極少。胞外多糖是細(xì)菌生物膜的主要成分，它決定了生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。最新研究表明，伴放線放線桿菌是侵襲性牙周炎的主要致病菌，它產(chǎn)生的β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺是其生物膜的主要成份，在生物膜形成和致病性方面發(fā)揮著重要作用。因此，本論文旨在

3、從海洋微生物中篩選降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺的多糖水解酶，并研究其抗牙菌斑細(xì)菌生物膜的作用。 以β-l，6-N-乙酰葡聚糖胺為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從黃海海泥樣品中篩選到一株高產(chǎn)N-乙酰葡萄糖苷酶的菌株。經(jīng)16S rRNA技術(shù)鑒定，該菌株被鑒定為假交替單胞菌屬，命名為假交替單胞菌(Pseudoal teromonas sp.)QY403。 利用硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析技術(shù)，從菌株QY403的發(fā)酵

4、液上清中分離純化到一種N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1。該酶的分子量為40.2 kD；酶反應(yīng)的最適pH為6.0，pH穩(wěn)定范圍為5.0～7.2；最適反應(yīng)溫度為40℃，酶的活性在0～40℃之間基本穩(wěn)定； Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+、EDTA對(duì)于酶的活性有促進(jìn)作用，而Cu2+、Ni2+對(duì)于酶的活性有抑制作用，SDS可以使酶完全失去活性。酶的底物專一性分析結(jié)果表明該酶能特異性降解β-1，6-N-乙酰葡聚糖胺。

5、 在上述研究的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步研究了N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1的抗A.a生物膜作用，并且從細(xì)胞因子產(chǎn)生的角度觀察了NagY1對(duì)A.a致病性的影響。首先，利用A.a的體外生物膜模型，評(píng)價(jià)了不同濃度的NagY1對(duì)A. a生物膜形成的抑制作用和對(duì)已形成生物膜的清除作用。結(jié)果顯示，NagY1對(duì)A.a生物膜形成具有顯著的抑制作用(>50％)，并且對(duì)已形成生物膜的清除率為74.5％(P<0.05)。其次，研究了A.a生物膜刺激對(duì)人牙周韌帶細(xì)胞

6、產(chǎn)生細(xì)胞因子RANKL、IL-6、IL-1 B、IL-8、IFN-Y的影響以及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶降解A.a生物膜對(duì)牙周韌帶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響。將A.a生物膜與原代培養(yǎng)的人牙周韌帶細(xì)胞共培養(yǎng)0-9h，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)人牙周韌帶細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量，分別與浮游A.a刺激組以及空白對(duì)照組進(jìn)行比較分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A.a生物膜和浮游菌刺激均可以提高人牙周韌帶細(xì)胞的IL-1β、IL-8、IFN-YmRNA表達(dá)量；A

7、.a生物膜比A.a浮游菌具有更強(qiáng)地刺激人牙周韌帶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子RANKL、 IL-6、IL-1β、IL-8、IFN-Y mRNA的作用(P<0.05)。N-乙酰葡萄糖苷酶NagY1降解A.a生物膜，使A.a生物膜刺激細(xì)胞人牙周韌帶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量較明顯降低。 綜上所述，本論文篩選得到一株高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的海洋交替假單胞茵，并從其發(fā)酵上清液中成功地分離純化了一種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NagY1：NagY