凡納濱對蝦殼膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶性質及活力調控.pdf

1、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是全世界三大養(yǎng)殖對蝦之一，具有重要的經(jīng)濟價值。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase或NAGase，EC.3.2.1.52)在對蝦的幼體孵化，蛻殼發(fā)育，營養(yǎng)代謝，免疫防御中發(fā)揮著重要作用。探討殼膜中NAGase的酶學特性、活力調控、催化作用機理并與內(nèi)臟中NAGase性質與功能進行比較，能更全面地了解凡納濱對蝦不同組織來源的NAGas

2、e特點及作用。
　　 以凡納濱對蝦殼膜為材料，經(jīng)過0.01mol/L Tris-HC1(pH7.5)緩沖液勻漿抽提處理，硫酸銨分級鹽析純化，獲得粗酶。粗酶再經(jīng)過Sephadex G-100凝膠層析，DEAE-32離子交換柱層析純化得到比活力為1077 U/mg的NAGase純酶制劑。SDS-PAGE凝膠電泳測得其亞基分子量為83kDa，通過Sephadex G-200凝膠過濾柱層析法測定該酶的分子量約為160kDa，說明該酶是由

3、兩個相同的亞基構成。酶的凝膠電泳活性染色發(fā)現(xiàn)殼膜NAGase的分子量較內(nèi)臟的大。等電點pI約為5.65。該酶水解pNP-NAG的最適pH為5.4，最適溫度為35℃，酶的穩(wěn)定性研究表明在溫度小于40℃，pH在5.0-10.0較穩(wěn)定。這些性質與從內(nèi)臟中分離純化的NAGase均有差異。伴刀豆蛋白(Con A) sepharose凝膠柱檢測該酶并非糖蛋白。
　　 進一步對殼膜NAGase進行研究。該酶在pH5.4的體系中催化水解pNP-

4、NAG的Km為0.247mmol/L。金屬離子對酶活力影響結果表明：K+、Na+、Li+、Mg2+對酶活力沒有影響；Al3+在較低濃度下對微弱的激活作用；Co2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+有不同程度的抑制。Zn2+對該酶有較強的抑制作用，抑制效應為可逆的，抑制類型為非競爭性，其IC50為1.5mmol/L，抑制常數(shù)K1為1.56mmo1/L。以熒光發(fā)射光譜研究酶經(jīng)不同濃度Zn2+作用后的分子構象變化。隨著Zn2+濃度的增大

5、熒光發(fā)射強度減弱，但沒有發(fā)生紅移現(xiàn)象。說明Zn2+與酶結合不導致酶分子構象改變只導致酶活力抑制。
　　 酶活性基團研究結果表明：色氨酸的吲哚基、組氨酸的咪唑基、酸性氨基酸的羧基和賴氨酸的ε-氨基是酶的活性功能基團。半胱氨酸的巰基與酶活力有一定的關系，酶的活力與二硫鍵及精氨酸殘基無關。溴乙酸對酶抑制作用的研究表明抑制效應為可逆的，抑制類型為非競爭性，抑制常數(shù)K1為1.56mmol/L。
　　 變性劑SDS對酶有較強的抑制作

6、用，尿素鹽酸胍對酶活力也有抑制作用，而Na2EDTA對酶活力沒有影響。環(huán)境激素類物質DBP，DOP對分離純化的NAGase活力有抑制作用，但對活體中NAGase影響隨計量和時間的變化而不同，其中有一個活力上升的階段，推測可能是因為類雌激素物質與雌激素受體結合，導致對蝦分泌較多的與“生殖蛻殼”相關的蛋白，表現(xiàn)為NAGase活力的增高，并導致對蝦正常的生命體征發(fā)生改變和死亡率的升高。一定濃度的鹽酸甜菜堿對純化NAGase有抑制作用，抑制效應