DNA-PKcs對c-myc蛋白穩(wěn)定性調(diào)控作用的研究.pdf

1、DNA-PKcs是DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位(DNADependentProteinKinaseCatalyticSubunit)，與另外兩個亞單位Ku70和Ku80共同構成DNA-PK復合物。與ATM、ATR等同屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3kinase-relatedproteinkinase，PIKK)超家族成員。最初確定的DNA-PKcs的功能是參與DNA雙鏈斷裂的非同源末端

2、連接(NHEJ)和V(D)J重組，后來又發(fā)現(xiàn)其在維持染色體端粒末端結構穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的作用。研究顯示DNA-PKcs以其絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶活性可磷酸化多種重要的功能蛋白底物，包括有多種癌基因產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos、c-myc、oct-1、c-jun等，表明DNA-PKcs是一種具有多種功能的蛋白。 近年來有越來越多的實驗研究報道，DNA-PKcs在腫瘤組織中異常高表達。如Hosoi等發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤組織中DNA-P

3、Kcs的mRNA和蛋白水平以及激酶活性均高于正常組織，Um等發(fā)現(xiàn)在侵襲轉(zhuǎn)移能力強的腫瘤組織中DNA-PKcs的蛋白表達和激酶活性高于侵襲轉(zhuǎn)移能力低的腫瘤細胞，由此推測DNA-PKcs與腫瘤轉(zhuǎn)移相關聯(lián)。此外，某些組織來源細胞的不同發(fā)育階段DNA-PKcs的表達水平也不同，生殖細胞減數(shù)分裂前DNA-PKcs表達明顯高于減數(shù)分裂后，而一些沒有增殖能力的細胞根本不表達DNA-PKcs或DNA-PKcs表達水平非常微弱。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，在

4、輻射誘發(fā)的部分癌變細胞中DNA-PKcs表達和激酶活性均顯著提高；通過免疫組化分析顯示約90％的肝癌患者的癌組織中DNA-PKcs表達呈強陽性，而對照的正常肝組織中所檢測到的DNA-PKcs水平明顯要低；發(fā)現(xiàn)肺癌組織中DNA-PKcs的蛋白水平和激酶活性也明顯高于癌旁組織。本論文在前期研究結果的啟示下，對DNA-PKcs的功能以及作為抗癌靶分子的可行性進行深入研究，取得了如下主要進展： (1)利用DNA-PKcs抑制劑三氟拉嗪(

5、TFP)和γ射線分別處理HeLa細胞，結果顯示TFP對HeLa細胞的生長有明顯的抑制作用，并誘發(fā)細胞凋亡，隨著藥物劑量的增大和用藥時間的延長，細胞生長速度減慢，凋亡率增加，而且TFP可增加細胞對輻射的敏感性。進一步分析其分子機制發(fā)現(xiàn)，TFP或γ射線作用HeLa細胞后，都可誘導DNA-PKcs的降解，而且TFP可增加射線導致細胞內(nèi)DNA-PKcs的切割降解程度，從而促進細胞凋亡的發(fā)生，增強細胞對輻射的敏感性。另外，MAPK激酶p38激活被

6、認為在HeLa細胞中起對抗凋亡的作用，抑制p38活化可有效促進細胞凋亡的發(fā)生，實驗結果表明TFP可抑制γ射線誘導的p38磷酸化，從而促進細胞凋亡。 (2)為了進一步研究DNA-PKcs在腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化中的作用，我們利用更為特異的RNA干擾技術(siRNA)成功的使DNA-PKcs蛋白表達下降，獲得了DNA-PKcs表達沉默的穩(wěn)定細胞模型。結果表明細胞對γ射線及紫外線的敏感性增加，DNA-PKcs表達沉默細胞的生長速度和接種裸

7、鼠后形成腫瘤的生長速度減慢。這些結果表明DNA-PKcs除通過其DNA修復功能影響細胞的輻射敏感性外，還可能與腫瘤細胞增殖有關。 (3)利用基因芯片技術對DNA-PKcs表達沉默細胞以及對照細胞進行了細胞信號轉(zhuǎn)導相關基因的mRNA表達水平比較，發(fā)現(xiàn)15個與細胞信號轉(zhuǎn)導有關的基因在DNA-PKcs表達沉默細胞中表達升高，其中一半是與干擾素信號轉(zhuǎn)導反應有關的基因。8個基因表達下降，包括有細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關基因等。RT-PCR半定

8、量分析結果與芯片結果相一致。又利用SEAP報告質(zhì)粒系統(tǒng)進行檢測，進一步證實其中的NFAT轉(zhuǎn)錄活性下降。以上結果提示DNA-PKcs具有直接或間接調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導相關基因的表達，而且大多與細胞增殖分化有關。值得注意的是，其中部分是c-myc的靶基因如P21、P27、NDRG-1。 (4)鑒于DNA-PKcs影響表達的部分基因是c-myc蛋白的靶基因，利用DNA-PKcs沉默表達細胞模型，進一步探討了DNA-PKcs新的生化功能。利

9、用Westernblot檢測原癌基因c-myc的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達抑制后，c-myc蛋白表達水平明顯下降，細胞中c-myc蛋白對靶基因轉(zhuǎn)錄的激活作用也隨之降低。DNA-PKcs抑制劑Wortmannin同樣可抑制c-myc的蛋白表達和活性。但是在上述條件下c-myc的mRNA表達水平幾乎無任何變化，表明DNA-PKcs是在蛋白水平調(diào)節(jié)c-myc表達。進一步的免疫共沉淀實驗結果表明，DNA-PKcs與c-myc蛋白存在

10、相互結合作用。以上表明DNA-PKcs具有維持c-myc蛋白穩(wěn)定性的功能，DNA-PKcs有可能通過此信號通路在一定程度上參與細胞的惡性轉(zhuǎn)化。 (5)DNA-PKcs如何調(diào)控c-myc蛋白穩(wěn)定性是本研究進一步關注的焦點，根據(jù)最新的文獻資料和本研究的實驗結果，我們提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信號通路，為此又做了進一步分析驗證。用泛素化蛋白酶體的抑制劑(MGl32)及GSK3抑制劑氯化鋰(LiCl)分別處理

11、細胞，結果表明MGl32和LiCl處理后能逆轉(zhuǎn)DNA-PKcs表達沉默后細胞中c-myc蛋白水平的下降，這樣為確認DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc信號通路提供了關鍵性實驗依據(jù)。 (6)本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs可與CyclinT2相互結合，而CyclinT2參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，因此我們推測也許DNA-PKcs在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(TCR)中起著一定的作用。為了驗證DNA-PKcs的TCR功能，首先建立了一種

12、基于DNA鏈特異性PCR方法檢測DNA轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復的新技術，利用此技術研究發(fā)現(xiàn)，對照細胞NC中DHFR基因轉(zhuǎn)錄鏈的修復要明顯快于非轉(zhuǎn)錄鏈以及DNA-PKcs表達沉默細胞的基因轉(zhuǎn)錄鏈，而兩組細胞的泛基因組修復水平無明顯差異，首次表明DNA-PKcs參與DNA轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復反應。 本課題研究首次發(fā)現(xiàn)了DNA-PKcs對c-myc蛋白穩(wěn)定性的影響，并提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信號調(diào)節(jié)通路，為闡述DNA-PKc