鹽誘導(dǎo)激酶SIK2與DNA-PKcs相互作用的鑒定.pdf

1、目的：利用SIK2敲低細(xì)胞系，研究SIK2敲低對(duì)細(xì)胞DNA輻射損傷修復(fù)能力的影響，推測(cè)SIK2在輻射損傷修復(fù)中的作用。分別在細(xì)胞水平和體外檢測(cè) SIK2與DNA-PKcs之間的相互作用，進(jìn)一步明確其相互作用與細(xì)胞周期的關(guān)系及相互作用的區(qū)域。
　　方法：將HeLa-shNC細(xì)胞和HeLa-shSIK2細(xì)胞經(jīng)4Gyγ射線照射，利用彗星電泳檢測(cè)其相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的尾矩，以此判斷它們DNA輻射損傷修復(fù)能力的差異，并推測(cè)SIK2在DNA損傷修復(fù)中

2、的作用。利用TdR雙阻斷法將HeLa細(xì)胞同步于G1/S期，然后釋放出來(lái)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫共沉淀技術(shù)，分別檢測(cè)SIK2和DNA-PKcs蛋白在S期（釋放后2h）、G2/M期（釋放后9h）和G1期（釋放后12h）相互作用的強(qiáng)弱，以此推測(cè)二者相互作用的細(xì)胞周期時(shí)相相關(guān)性。設(shè)計(jì)SIK2及其截短體引物，運(yùn)用PCR方法分別擴(kuò)增SIK2、SIK2-Δ1（280~926）、SIK2-Δ2（400~926）、SIK2-Δ3（1~400）、SIK2

3、-Δ4（700~926）五個(gè)基因片段，將目的片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2中，構(gòu)建GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3、SIK2-Δ4和GST空載的原核表達(dá)，用考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot進(jìn)行鑒定。用誘導(dǎo)表達(dá)成功的GST-SIK2、GST-SIK2-Δ1、GST-SIK2-Δ2、GST-SIK2-Δ4蛋白與內(nèi)源性DNA-

4、PKcs蛋白行GST pull-down實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SIK2蛋白與DNA-PKcs蛋白在體外的相互作用及相互作用區(qū)域。
　　結(jié)果：1.彗星電泳顯示，HeLa-shSIK2的尾矩在照射完1h和2h較HeLa-shNC長(zhǎng)，說(shuō)明SIK2敲低后，細(xì)胞對(duì)于輻射誘發(fā)DNA損傷的修復(fù)能力降低，SIK2可能參與輻射誘發(fā)的DNA損傷修復(fù)。2.用TdR雙阻斷法分別使細(xì)胞同步化于S期、G2/M期和G1期，用免疫共沉淀技術(shù)分別檢測(cè)二者在這三個(gè)時(shí)期的相互作用

5、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者在整個(gè)細(xì)胞周期都有作用，其中G2/M期和G1期形成的蛋白復(fù)合物較多，提示它們可能主要在G2/M期和G1期相互作用。3.成功構(gòu)建了SIK2及其截短體的原核表達(dá)重組體，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用考馬斯亮藍(lán)染色及 Western blot鑒定顯示，GST-SIK1~926、GST-SIK280~926、GST-SIK400~926、GST-SIK1~400、GST-SIK700~926和GST分別位于130KD、110KD、84

6、KD、72KD、54KD和26KD左右，均與預(yù)期分子量大小相符。4.用GST pull-down檢測(cè)SIK2蛋白與DNA-PKcs蛋白的體外相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，GST-SIK1~926、GST-SIK280~926和GST-SIK400~926在體外能與DNA-PKcs相結(jié)合，而GST-SIK700~926在體外不能結(jié)合DNA-PKcs，由此推測(cè)，在體外能與DNA-PKcs結(jié)合的區(qū)域位于SIK2的PKA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論：1.SI