ITS2二級結(jié)構(gòu)在藥用植物DNA條形碼鑒定中的可行性.pdf

1、準確的物種鑒定是保證中醫(yī)藥療效與安全的先決條件。傳統(tǒng)中藥材的鑒定方法，如基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定常常存在主觀性強、穩(wěn)定性差等缺點，因而使鑒定不夠精準。DNA條形碼技術(shù)作為物種鑒定的新技術(shù)克服了上述方法的缺點，已被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定。其中ITS2作為中藥材鑒定的核心DNA條形碼已經(jīng)被納入《中國藥典》，但分辨力不足嚴重制約了其推廣使用，需要進一步挖掘其有利于中藥鑒定的系統(tǒng)發(fā)育信息。ITS2在細胞中主要是依靠二級結(jié)構(gòu)形式來實

2、現(xiàn)它的功能，其中蘊含著核酸序列所不具有的系統(tǒng)發(fā)育信息。部分類群的研究表明，在基于ITS2的系統(tǒng)發(fā)育分析中加入二級結(jié)構(gòu)信息能夠改善其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，但是ITS2二級結(jié)構(gòu)改善系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果的程度以及二級結(jié)構(gòu)信息能否應(yīng)用于藥用植物DNA條形碼鑒定中，尚不明確。而RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、比對和編碼技術(shù)的日漸成熟，也為進一步探究及利用ITS2二級結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育信息提供了可能。
　　本研究通過測序或GenBank獲取ITS/ITS2序列，通過G

3、enBank注釋和Hidden Markov模型界定ITS2邊界。以屬為單位將ITS2序列矩陣導(dǎo)入LocARNA軟件構(gòu)建并比對二級結(jié)構(gòu)，使用改良后的RNAstat編碼產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)信息。利用PAUP建樹軟件以最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終建立ITS2二級結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析體系。本研究選取茄屬（Solanum L.）藥用植物及中藥“木通”(Akebia quinata(Houtt.) Decne.)為研究對象，探究ITS2二級結(jié)構(gòu)信息在藥用

4、植物DNA條形碼鑒定中的實際物種分辨率。在此基礎(chǔ)上，基于GenBank已有數(shù)據(jù)將研究擴大至種子植物100個屬，以全面評估ITS2二級結(jié)構(gòu)信息提升物種分辨率的能力。
　　研究結(jié)果表明:(1)在木通植物中，加入ITS2二級結(jié)構(gòu)信息，系統(tǒng)樹的物種分辨率提高了33％，且成功地將木通與其混偽品分開;在茄屬藥用植物類群中，加入二級結(jié)構(gòu)信息后，很好地解決了茄屬幾種藥用植物的鑒定問題。(2)常規(guī)的序列比對(Clustal X)方法可能存在缺陷，因

5、為它和基于二級結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)的核酸序列比對（LocARNA）產(chǎn)生的矩陣在長度、插入/缺失的大小和位置在多數(shù)屬中存在一定的差異。(3)在種子植物類群中，將ITS2二級結(jié)構(gòu)信息加入系統(tǒng)發(fā)育分析中，能夠使ITS2核酸矩陣長度增加約31％，變異位點數(shù)增加約46％，信息位點數(shù)增加約45％;在該信息與核酸信息聯(lián)合分析構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，所有屬的系統(tǒng)樹支持率均有增加，但只有23(23％)個屬的物種分辨率得到提升，物種分辨率平均提升8％，這使ITS2序列與I