旅順產(chǎn)白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi brevicaudus）蛇毒去整合素的提取與純化.pdf

1、去整合素 蛇毒因其廣泛的生物活性早已引起了國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的注意。人們從蛇毒中提出了許多具有潛在臨床應(yīng)用前景的單一組分。其中，去整合素(disintegrins)為一組源自于出血性蛇毒的抗黏附多肽或蛋白質(zhì)的總稱(chēng)，因其可強(qiáng)力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征為富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)親水性氨基酸序列，分子量?jī)H為5kD～9kD，多為單鏈多肽或蛋白分子。此蛇毒

2、蛋白家族可憑借其分子中RGD序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑；因RGD模體能被血小板纖維蛋白原受體αⅡβ3識(shí)別，其還具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。因此，去整合素可運(yùn)用于與細(xì)胞黏附相關(guān)的疾病研究領(lǐng)域，如血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓癥等。關(guān)于去整合素的功能研究，國(guó)內(nèi)外已有的相關(guān)報(bào)道為：臺(tái)灣的Rhodostomin[1]和Accutin[2]、韓國(guó)的Salmosin[3,4]和Saxatilin[5]

3、、美國(guó)的Contortrostatin[6]等，這些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制血小板聚集等功效[1-9]。 整合素為一細(xì)胞表面受體的異源二聚體家族，是一組跨膜糖蛋白。迄今為止，已知有18種不同的α亞基和8種不同的β亞基組成至少24種的異源二聚體[10-12]。α及β亞基的N末端(胞外端)共同構(gòu)成配體結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)榇蟛糠旨?xì)胞整合素都識(shí)別RGD氨基酸順序，而大多數(shù)ECM蛋白都含有RGD順序，所以RGD序

4、列已被公認(rèn)為是ECM成分與細(xì)胞整合素結(jié)合的位點(diǎn)[13]。整合素胞內(nèi)部分較短，但可以通過(guò)α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)、踝蛋白(talin)和粘著斑蛋白(vinculin)與細(xì)胞骨架相連。整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與ECM之間的黏附，并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞的黏附，增殖，分化，轉(zhuǎn)移，調(diào)亡起到重要的調(diào)控作用，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]。 目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從產(chǎn)于中國(guó)旅順的白眉蝮蛇(Gloydi

5、us blomhohffibrevicaudus)毒腺中提取總RNA，利用自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。測(cè)序結(jié)果顯示，其與韓國(guó)的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高：DNA序列同源性為95.8％，蛋白質(zhì)序列同源性為91.8％，且蛋白質(zhì)中含有去整合素的特征模體RGD及12個(gè)半胱氨酸。本研究室將此去整合素基因進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)后，得到了該蛋白的可溶性高效表達(dá)。經(jīng)組氨酸親和層析純化，獲得

6、了分子量為9kD的均質(zhì)蛋白，將其命名為rAdinbitor。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，rAdinbitor能夠有效的抑制血小板的聚集，對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)和增殖也有明顯的抑制作用。 為了近一步比較白眉蝮蛇蛇毒中去整合素和rAdinbitor在結(jié)構(gòu)、功能方面的差同，完善本試驗(yàn)室對(duì)蛇毒去整合素的制備工藝，本試驗(yàn)嘗試從旅順產(chǎn)白眉蝮蛇蛇毒中進(jìn)行去整合素的分離和純化。主要做了如下工作： 1)利用凝膠過(guò)濾與反相高效液相色譜對(duì)旅順產(chǎn)白眉蝮蛇蛇

7、毒去整合素進(jìn)行純化，通過(guò)血小板凝集抑制試驗(yàn)對(duì)各洗脫組分進(jìn)行活性鑒定以確定去整合素所在組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)串聯(lián)凝膠過(guò)濾和反相高效液相色譜，得到了分離純化的白眉蝮蛇去整合素。Tricine SDS-PAGE電泳后銀染，呈現(xiàn)出兩條清晰、分離的蛋白條帶，分子量分別為12kD和17kD。 2)利用凝膠過(guò)濾和離子交換層析對(duì)旅順白眉蝮蛇去整合素進(jìn)行純化，通過(guò)血小板凝集抑制試驗(yàn)對(duì)各洗脫組分進(jìn)行活性鑒定確定去整合素所在組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通