支原體MALP-2誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)HO-1負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子分泌.pdf

1、背景與目的：支原體感染后所致的炎癥反應(yīng)是其引起病理損傷的重要因素。研究顯示，支原體的主要致炎物質(zhì)膜脂蛋白及其衍生物巨噬細(xì)胞活化脂肽2（Mycoplasma macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）可激活人單核、巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分泌一系列促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)，從而參與支原體感染后的免疫應(yīng)答和病理損傷。血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）是催化血紅素降解為 Fe2+、一氧

2、化碳和膽綠素的限速酶。HO-1及其產(chǎn)物對(duì)多種因素所致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有調(diào)控作用。研究顯示，多種病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）作用于固有免疫系統(tǒng)后，可誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表達(dá)HO-1，從而發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用。本課題組前期研究也表明，MALP-2處理人單核細(xì)胞后，可激活核轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2并增強(qiáng) HO-1的活性，從而在一定程度上負(fù)向調(diào)控環(huán)氧化酶

3、-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)，但其上游信號(hào)通路仍不明了。本研究旨在進(jìn)一步研究 MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響。
　　方法：（1）體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系 THP-1，用 Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）或TLR6中和抗體孵育1h，或轉(zhuǎn)染TLR2負(fù)顯性突變體（Dominant negative TLR2，DN-TLR2）或DN-TLR6，隨

4、后用5ng/mL MALP-2刺激16h，Western blot觀察阻斷TLR2或TLR6后對(duì) HO-1蛋白表達(dá)的影響；構(gòu)建 HO-1啟動(dòng)子報(bào)告基因pGL3-HO-1-luc質(zhì)粒，連同DN-TLR2或DN-TLR6轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，觀察MALP-2作用后HO-1啟動(dòng)子活性的改變情況，以證實(shí)TLR2和TLR6在介導(dǎo)HO-1表達(dá)中的作用；（2）MALP-2刺激THP-1細(xì)胞0～30min，Western blot分析c-Src的磷酸化情

5、況；采用c-Src抑制劑PP1預(yù)處理細(xì)胞或轉(zhuǎn)染c-Src siRNA，觀察c-Src是否參與HO-1表達(dá)；（3） THP-1細(xì)胞用MALP-2刺激0～20min，Western blot分析Bruton’s酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，Btk）的磷酸化；采用PP1處理細(xì)胞，或用siRNA干擾c-Src表達(dá)，觀察其對(duì)Btk磷酸化的影響，以證實(shí)c-Src是否參與Btk的激活；隨后采用Btk抑制劑LFM-A13

6、預(yù)處理THP-1細(xì)胞，觀察其對(duì)HO-1蛋白表達(dá)及啟動(dòng)子活性的影響，以證實(shí) Btk在介導(dǎo) HO-1表達(dá)中的作用；（4）MALP-2刺激細(xì)胞前采用MyD88或Mal siRNA干擾其表達(dá)，或采用DN-MyD88或DN-Mal轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察MyD88和Mal對(duì)HO-1蛋白表達(dá)以及啟動(dòng)子活性的影響；（5）Western blot檢測(cè)MALP-2刺激細(xì)胞0～60min后Akt的磷酸化情況；采用PP1和LFM-A13預(yù)處理細(xì)胞，或用Mal、MyD8

7、8 siRNA分別沉默其表達(dá)，觀察 MALP-2處理后Akt的磷酸化情況，以證實(shí)c-Src、Btk、Mal或 MyD88是否參與 PI3K的激活；隨后采用 PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞，觀察PI3K是否參與HO-1表達(dá)；最后采用免疫共沉淀檢測(cè) MALP-2處理后能否誘導(dǎo)形成c-Src/Btk/Mal/MyD88/p85α復(fù)合體，以證實(shí)其直接相互作用；（6）采用LY294002處理細(xì)胞或轉(zhuǎn)染MyD88 siRNA，分別采用免疫

8、熒光和凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)觀察核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合活性，以證實(shí)MALP-2能否通過PI3K或MyD88激活Nrf2；（7）細(xì)胞經(jīng)MALP-2刺激前采用siRNA分別干擾HO-1或Nrf2的表達(dá)，或采用HO-1抑制劑鋅原卟啉（Zinc protoporphyrin，ZnPP）處理，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)，ELISA檢測(cè)TNF-α，IL-6，IL-10的分泌以及NF-κB的活性；構(gòu)建pcDNA3.1

9、-HO-1表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞使其過表達(dá)HO-1，或采用HO-1激動(dòng)劑鈷原卟啉（Cobalt protoporphyrin，CoPP）和萊菔硫烷（Sulforaphane，SFN）處理細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后對(duì)TNF-α和IL-1β的分泌及NF-κB活性的影響，以證實(shí)HO-1在負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子分泌中的作用。
　　結(jié)果：（1）TLR2或TLR6中和抗體預(yù)處理細(xì)胞后，可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞表達(dá) HO-1；同時(shí)，采

10、用 DN-TLR2或DN-TLR6轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可下調(diào) HO-1蛋白表達(dá)及其啟動(dòng)子活性；（2） MALP-2可誘導(dǎo)c-Src磷酸化；采用c-Src抑制劑PP1預(yù)預(yù)處理，或采用c-Src siRNA干擾其表達(dá)后，HO-1表達(dá)降低；（3）MALP-2處理THP-1細(xì)胞5min內(nèi)即可誘導(dǎo)Btk磷酸化，10min后達(dá)到峰值，而PP1處理以及c-Src siRNA干擾后均可抑制Btk的磷酸化；此外，Btk抑制劑 LFM-A13預(yù)處理后，HO-1蛋白表

11、達(dá)以及其啟動(dòng)子活性顯著降低；（4）采用siRNA沉默MyD88或轉(zhuǎn)染DN-MyD88均不能下調(diào)HO-1表達(dá)，而轉(zhuǎn)染Mal siRNA或DN-Mal可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)；雖然轉(zhuǎn)染 DN-MyD88可輕度抑制 HO-1啟動(dòng)子活性，但其抑制效應(yīng)明顯低于DN-Mal轉(zhuǎn)染組；（5）MALP-2刺激THP-1細(xì)胞5min后即可誘導(dǎo)Akt磷酸化，15min后到達(dá)峰值，c-Src和Btk抑制劑PP1和LFM-A13處理均可抑制其激活；

12、RNA干擾Mal表達(dá)后，Akt磷酸化顯著降低并將其低水平維持至120min以上。而轉(zhuǎn)染MyD88 siRNA并經(jīng)MALP-2刺激15min后，Akt磷酸化明顯降低，但60min后Akt磷酸化水平恢復(fù)正常；PI3K抑制劑 LY294002預(yù)處理可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)；此外，免疫共沉淀顯示，MALP-2處理10min后可誘導(dǎo)c-Src/Btk/Mal/MyD88/p85α形成復(fù)合體；（6）MALP-2處理1h可明顯誘導(dǎo) Nr

13、f2核轉(zhuǎn)位并結(jié)合至 HO-1的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）；PI3K抑制劑LY294002處理后，Nrf2核轉(zhuǎn)位以及DNA活性明顯降低，而轉(zhuǎn)染MyD88 siRNA對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位以及DNA結(jié)合無明顯影響；（7）RNA干擾HO-1或Nrf2表達(dá)可上調(diào)MALP-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)并分泌TNF-α及IL-6，同時(shí)能增強(qiáng)NF-κB的活性，但對(duì)IL-10分泌無明顯影響；采用HO-1抑制