熒光素酶標(biāo)記的重組流感病毒(IAV-Gluc)構(gòu)建及其呼吸道沉積可視化研究.pdf

1、近年來(lái)，頻繁爆發(fā)的甲型流感不僅給人類的生命健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅，而且給經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失，甚至影響到了社會(huì)穩(wěn)定。通過(guò)氣溶膠傳播、擴(kuò)大感染范圍是其能引起全球大流行的一個(gè)重要因素。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感就是因病毒能經(jīng)氣溶膠傳播，具有強(qiáng)大的人傳人能力，而被世界衛(wèi)生組織（WHO）將警戒級(jí)別提至最高級(jí)—6級(jí)。該事件進(jìn)一步引發(fā)了人們對(duì)流感病毒氣溶膠傳播機(jī)理研究的關(guān)注。但是目前對(duì)于流感病毒的氣溶膠傳播機(jī)制還不是十分清楚。影響流感病毒氣溶膠傳播

2、效率的因素有很多，如環(huán)境因素、流感病毒自身的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸序列、宿主呼吸道唾液酸相關(guān)的受體類型、體內(nèi)的抗病毒藥物或疫苗免疫水平、在呼吸道的沉積效率等。與研究病毒氣溶膠擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)同等重要的是，監(jiān)測(cè)具有氣溶膠傳播特性的流感病毒在感染宿主過(guò)程中呼吸道內(nèi)載量的動(dòng)態(tài)變化，能為流感病毒的組織嗜性、復(fù)制與清除規(guī)律、致病與傳播分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，對(duì)于進(jìn)一步研究流感病毒的氣溶膠傳播機(jī)制具有重大意義。目前，傳統(tǒng)的病毒體內(nèi)沉積研究方法需要大

3、量使用動(dòng)物，在不同的時(shí)間點(diǎn)剖檢，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且存在較大的生物安全隱患。而活病毒標(biāo)記及可視化研究能夠有效克服上述不足，可以實(shí)時(shí)、便捷地反映病毒感染過(guò)程。
　　本課題利用反向遺傳操作技術(shù)，在甲型H1N1流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的NA末端插入外源熒光素酶基因Gluc（Gaussia luciferase），構(gòu)建可視化的重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc），為開(kāi)展流感病毒動(dòng)物感染研究提供了

4、一種實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、可視化監(jiān)測(cè)呼吸道病毒載量變化的方法。該方法通過(guò)檢測(cè)活體動(dòng)物呼吸道生物發(fā)光情況，快速確定病毒的組織分布及載量情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)病毒載量連續(xù)、實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、可快速定性定量等特點(diǎn)。
　　本研究共分四部分：
　　一是完成了IAV-Gluc的構(gòu)建與鑒定。以A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株為骨架，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建8個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒，將8個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（

5、人胚胎腎細(xì)胞），轉(zhuǎn)染上清接種9日齡的SPF雞胚，進(jìn)行重組病毒IAV-Gluc拯救。通過(guò)凝集試驗(yàn)（HA）、基因擴(kuò)增、形態(tài)學(xué)觀察、熒光素酶基因表達(dá)水平的驗(yàn)證和鑒定，均證實(shí)了重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc）構(gòu)建成功，且該病毒能夠穩(wěn)定表達(dá)Gluc。
　　二是完成了IAV-Gluc生物學(xué)特性研究。本研究從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性六個(gè)方面對(duì)拯救毒株IAV-Gluc的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析比較

6、。結(jié)果表明，IAV-Gluc能夠在P1-P5代穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因，且在5代間表達(dá)無(wú)顯著差異；致病力約為野生毒PR8的1/1000；在豚鼠間獲得了100％的直接接觸傳播與氣溶膠傳播能力，與野生毒株一致；在SPF雞胚上增殖能力約為野生毒的1/20，增殖曲線無(wú)明顯差異；與野生毒的神經(jīng)氨酸酶相對(duì)活性不存在顯著性差異，表明對(duì)病毒的釋放能力無(wú)影響；二者均表現(xiàn)出完全的α2,3唾液酸受體結(jié)合能力。上述結(jié)果表明獲得的IAV-Gluc除致病力減弱外，極大

7、地保留了野生毒株的生物學(xué)特性。
　　三是完成了IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積的可視化監(jiān)測(cè)研究。本研究結(jié)合體外成像技術(shù)，分析了病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制、清除的動(dòng)態(tài)過(guò)程。以IAV-Gluc滴鼻感染BALB/c小鼠（5×103EID50/只）后，利用IVIS SPECTRUM體外成像系統(tǒng)對(duì)其體內(nèi)的病毒載量進(jìn)行連續(xù)6天的可視化監(jiān)測(cè)，24h即能在體外檢測(cè)到生物發(fā)光信號(hào)，48h后達(dá)到峰值。生物發(fā)光來(lái)源為小鼠肺部和氣管，且肺部的生物熒光強(qiáng)度與病毒滴度

8、有極強(qiáng)的正相關(guān)線性關(guān)系（R2=0.9866）；同時(shí)，建立了生物發(fā)光快速鑒定病毒感染的方法，相比于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù)來(lái)說(shuō)，不僅可以直接評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)活病毒載量，而且在保證準(zhǔn)確性前提下，大大縮短了樣品處理步驟和實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。
　　四是完成了不同感染方式下IAV-Gluc在呼吸道內(nèi)沉積與復(fù)制的比較研究。當(dāng)保證滴鼻與氣溶膠暴露兩種方式下攻毒的劑量相同（2.43×105 EID50）時(shí)，滴鼻時(shí)有12.27%的病毒到達(dá)豚鼠肺部且呈點(diǎn)狀分布

9、，氣溶膠暴露時(shí)有1.34%的病毒到達(dá)豚鼠肺部且呈均勻分布，后者導(dǎo)致病毒在48h內(nèi)更加有效的復(fù)制；從復(fù)制效率來(lái)看，氣溶膠暴露感染組的豚鼠肺部病毒載量持續(xù)增高48h后才開(kāi)始下降，最高載量為原始沉積量的11073倍，而滴鼻感染組的豚鼠肺部病毒載量在24h開(kāi)始下降，且最高載量?jī)H為原始沉積量的15.4倍。說(shuō)明氣溶膠暴露方式感染更有利于病毒在肺部的復(fù)制，比滴鼻方式具有更高的感染效能。
　　本研究成功構(gòu)建了攜帶Gaussia Luciferas

10、e基因的可視化重組熒光素酶甲型H1N1流感病毒（IAV-Gluc）；從穩(wěn)定性、致病性、傳播能力、增殖能力、NA活性及受體結(jié)合特性等方面鑒定，結(jié)果顯示該重組病毒極大地保留了野生毒株的生物學(xué)特性；滴鼻感染小鼠后在肺部和氣管內(nèi)可檢測(cè)到生物發(fā)光信號(hào)，并且生物發(fā)光強(qiáng)度與病毒滴度呈正相關(guān)；該病毒適用于對(duì)感染動(dòng)物的快速鑒定研究，在前處理和檢測(cè)時(shí)間上優(yōu)于傳統(tǒng)的qRT-PCR技術(shù)，而且能夠直接評(píng)價(jià)體內(nèi)的活病毒載量；同時(shí)，利用可視化病毒進(jìn)行氣溶膠暴露研究首