剛地弓形蟲4種能量代謝相關(guān)酶基因的克隆表達(dá)及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié).pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種廣泛寄生于人和溫血?jiǎng)游镉泻思?xì)胞內(nèi)的頂復(fù)門原蟲(Apicom-plexan)，并可以引發(fā)人畜共患的弓形蟲病（Toxoplasmosis）。弓形蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病原蟲，可以在免疫防御受損的個(gè)體中廣泛散播，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的疾病，例如弓形蟲性腦炎、腹膜炎等疾病。另外，弓形蟲病對(duì)畜牧業(yè)的危害也日益突出，弓形蟲可以通過(guò)母畜垂直感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等不良妊娠，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，近年

2、來(lái)弓形蟲病的診斷、治療以及其致病機(jī)理的研究已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。
　　目前，有關(guān)剛地弓形蟲能量代謝相關(guān)酶對(duì)剛地弓形蟲致病性的研究相對(duì)較少，對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能影響的研究幾乎沒(méi)有。本文選取了剛地弓形蟲參與能量代謝過(guò)程的四種酶:磷酸甘油酸變位酶1(PGAM1)、磷酸甘油酸變位酶2(PGAM2)、檸檬酸合成酶1(CS1)和蘋果酸脫氫酶(MDH)并對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)進(jìn)行初步研究。為進(jìn)一步了解弓形

3、蟲能量代謝相關(guān)酶在其致病過(guò)程中如何發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)。另外，本文研究結(jié)果還表明這四種能量代謝相關(guān)的酶均具有良好的抗原性，為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1.TgPGAM1、TgPGAM2和TgCS1基因的克隆和序列分析
　　提取從小鼠中收集的弓形蟲速殖子的RNA，mRNA用于合成cDNA，后者作為擴(kuò)增弓形蟲磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase，PGAM)、檸檬酸合成酶1(citrat

4、esynthase1，CS1)基因的模板。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增到TgPGAM1基因(GenBankaccession: XM_002371095.1)、TgPGAM2基因(GenBank accession: DQ457187.1)和TgCS1基因(GenBank accession: EF489424.1)。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，然后連接到pMD-19T克隆載體上。經(jīng)酶切鑒定，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和分析。結(jié)果證明，TgPGAM1基因的

5、ORF含798bp，編碼266個(gè)氨基酸，理論分子量29.26 kDa;TgPGAM2基因的ORF含795bp，編碼265個(gè)氨基酸，理論分子量29.15 kDa; TgCS1基因的ORF含1665bp，編碼555個(gè)氨基酸，理論分子量61.05 kDa。
　　2.TgPGAM1、TgPGAM2、TgCS1和TgMDH的原核表達(dá)和抗血清制備
　　為了獲得重組蛋白TgPGAM1、Tg PGAM2、TgCS1和TgMDH，首先用限制性

6、內(nèi)切酶酶切出克隆的DNA片段，回收之后，亞克隆到pET32a載體上，之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MDH為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的。用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。重組蛋白TgCS1和TgMDH均以包涵體形式存在，重組蛋白TgPGAM1、TgPGAM2存在于上清中。SDS-PAGE鑒定表達(dá)的重組蛋白，顯示各蛋白條帶的大小分別為:47kDa(PGAM1)、47kDa(PGAM2)、79kDa(CS1)34k

7、Da(MDH)。將重組蛋白經(jīng)過(guò)一系列的透析和復(fù)性，然后用純化復(fù)性后的重組蛋白免疫大鼠，制備rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH抗血清。然后用Western Blot技術(shù)來(lái)驗(yàn)證抗血清的特異性。結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH，均能被感染弓形蟲的雞血清識(shí)別，說(shuō)明自然感染情況下，4種酶能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生抗體。并且能檢測(cè)到天然狀態(tài)下這4種蛋白的存在，說(shuō)明速殖

8、子內(nèi)存在天然的四種酶，表明重組蛋白有很好的抗原性。
　　3.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH與小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的結(jié)合試驗(yàn)及對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　本部分研究旨在觀察重組蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞的結(jié)合情況及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖作用。將重組蛋白以20μg/mL的濃度加入細(xì)胞懸液中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)后收集細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)四種重組蛋白均能夠與小鼠巨噬細(xì)胞A

9、na-1結(jié)合。為了檢測(cè)重組蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖作用，將不同濃度的重組蛋白分別與細(xì)胞共作用24小時(shí)后，利用CCK-8法檢測(cè)增殖結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種重組蛋白顯著降低細(xì)胞的增殖活性。
　　4.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的吞噬、凋亡的影響
　　本部分研究進(jìn)行了四種重組蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、r

10、TgCS1和rTgMDH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬、凋亡的影響。分別用不同濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)作用后對(duì)Ana-1細(xì)胞吞噬的影響及是否促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。結(jié)果顯示，除了40和80μg/mL的rTgCS1降低對(duì)FITC-dextran的吞噬能力，Ana-1細(xì)胞經(jīng)rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgMDH和5、10、20μg/mL的rTgCS1刺激后，吞噬FIT

11、C-dextran的能力均顯著增加。不同濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgMDH和低濃度的rTgCS1均可以顯著誘導(dǎo)Ana-1細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，高濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2和低濃度的rTgCS1、rTgMDH可以顯著誘導(dǎo)Ana-1細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。
　　5.rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的細(xì)胞因子表達(dá)及NO分泌的影響
　　本研究的目的是觀察四

12、種弓形蟲重組蛋白rTgPGAM1、rTgPGAM2、rTgCS1和rTgMDH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的細(xì)胞因子表達(dá)及NO分泌的影響。用不同濃度的重組蛋白分別與小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1共培養(yǎng)，用ELISA檢測(cè)不同處理后的Ana-1細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-10的表達(dá)，用總一氧化氮檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NO的濃度。結(jié)果顯示，高濃度的rTgCS1和不同濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2(20和40μg/mL的除外)和

13、rTgMDH均可以促進(jìn)細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。不同濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2、和rTgMDH（5μg/mL除外）均可以促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β的分泌，不同濃度的rTgCS1均抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β的分泌。不同濃度的rTgPGAM1、rTgPGAM2均可以促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子TNF-α的分泌。與對(duì)照組相比，低濃度的rTgCS1和rTgMDH抑制TNF-α的分泌，高濃度的rTgCS1和rTgMDH促進(jìn)細(xì)胞因子