左歸丸調(diào)控衰老大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討左歸丸促進(jìn)衰老大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stemcells，MSC)增殖的調(diào)控機(jī)制。根據(jù)“腎精虧虛致衰老理論”和“干細(xì)胞具有先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式”理論假說，在前期左歸丸對(duì)衰老大鼠骨髓MSC增殖效應(yīng)的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探討左歸丸促進(jìn)衰老大鼠骨髓MSC增殖的分子調(diào)控機(jī)制。為“精”的干細(xì)胞學(xué)說提供更充分的科學(xué)依據(jù)，也為中醫(yī)藥干預(yù)干細(xì)胞移植治療難治性疾病提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴

2、全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)MSC，通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定骨髓MSC。⑵左歸丸調(diào)控衰老大鼠骨髓MSC增殖的機(jī)制：經(jīng)腹腔注射一定濃度D-半乳糖建立亞急性衰老大鼠模型。治療選用補(bǔ)腎益精經(jīng)方左歸丸水煎劑灌胃；細(xì)胞培養(yǎng)到P3代，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、LIF、OSF、SCF、SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA的表達(dá);Real-time PCR進(jìn)

3、一步檢測(cè)差異基因的表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)差異基因的蛋白表達(dá)水平；基因芯片技術(shù)篩選Wnt/β-Catenin信號(hào)通路中差異表達(dá)的基因，Western blot檢測(cè)差異基因的蛋白表達(dá)水平。⑶左歸丸對(duì)體外誘導(dǎo)的衰老骨髓MSC增殖效應(yīng)和機(jī)制的初步研究：運(yùn)用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)骨髓MSC。細(xì)胞培養(yǎng)至P3代，加入D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。左歸丸組給予含一定濃度左歸丸水煎劑的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)；細(xì)胞姬姆薩染色觀察細(xì)胞的形態(tài);細(xì)胞衰老β

4、-半乳糖苷酶染色評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老陽性率;MTT法、流式細(xì)胞周期術(shù)檢測(cè)比較各組細(xì)胞的增殖能力；RT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、LIF、OSF、SCF、SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA表達(dá)。Real-time PCR進(jìn)一步檢測(cè)差異基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠MSC表面標(biāo)志抗原，CD44表達(dá)為陽性，CD45表達(dá)為陰性。②左歸丸調(diào)控衰老大鼠骨髓

5、MSC增殖的機(jī)制：各組P3代細(xì)胞形態(tài):正常組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞呈梭形漩渦狀生長，胞核呈規(guī)則圓形;模型組細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞較大，胞核不規(guī)則，胞質(zhì)可見顆粒狀物質(zhì)，并見不同程度的細(xì)胞膜破裂;中劑量組細(xì)胞生長較好，胞核大部分呈規(guī)則分布，胞核可見少量顆粒狀物質(zhì)，未見明顯細(xì)胞膜破裂；Real-time PCR檢測(cè):衰老大鼠骨髓MSC SCFmRNA表達(dá)水平顯著低于正常組和中劑量組(P＜0.05)，p21mRNA表達(dá)顯著高于正常組和中劑量組(P＜0.

6、05)；Western blot檢測(cè):模型組SCF蛋白表達(dá)量顯著低于正常組(P＜0.01)、p21蛋白表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.01);中劑量組SCF蛋白表達(dá)量顯著高于模型組(P＜0.05)、p21蛋白表達(dá)量顯著低于模型組(P＜0.05)；在Wnt/β-Catenin信號(hào)通路89個(gè)相關(guān)基因中:與正常組比較，模型組表達(dá)上調(diào)基因有Kremenl、Kremen2、Wnt4等，表達(dá)下調(diào)基因有Wnt2、Wnt3a、Wnt7a等。與模型組比較，

7、中劑量組上調(diào)基因有Wnt2、Wnt3a、Jun等，表達(dá)下調(diào)基因有Kremen2、sFRP5、Wnt9b等；Western blot檢測(cè)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路差異基因的蛋白表達(dá)水平:模型組細(xì)胞Wnt3a表達(dá)量顯著低于正常組(P＜0.01)、Kremen2蛋白表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.01);左歸丸組細(xì)胞Wnt3a蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P＜0.05)、Kremen2蛋白表達(dá)量顯著低于模型組(P＜0.05)。③左歸丸對(duì)體外衰

8、老骨髓MSC增殖效應(yīng)和機(jī)制：姬姆薩染色:模型組P3代骨髓MSC呈現(xiàn)衰老細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，左歸丸干預(yù)治療后，各組大鼠骨髓MSC的細(xì)胞形態(tài)與正常組相近；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色:模型組骨髓MSC細(xì)胞衰老染色陽性率顯著高于正常組和左歸丸組(P＜0.01)；MTT結(jié)果顯示:模型組骨髓MSC增殖能力顯著低于正常組和左歸丸組(P＜0.01)；細(xì)胞周期檢測(cè):模型組的細(xì)胞多數(shù)停滯在DNA復(fù)制前期（G1期）（P＜0.01）;左歸丸干預(yù)治療后，停滯在G1期

9、的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），多數(shù)細(xì)胞快速進(jìn)入DNA復(fù)制期；Real-time PCR結(jié)果:模型組SCFmRNA表達(dá)水平顯著低于正常組和中劑量組(P＜0.05);模型組p21mRNA表達(dá)水平顯著高正常組和中劑量組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：⑴采用全骨髓貼壁法可獲得穩(wěn)定、均質(zhì)性良好的大鼠骨髓MSC。⑵左歸丸具有顯著的延緩干細(xì)胞衰老作用，可通過抑制Kremen2和促進(jìn)Wnt3a途徑激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，并促進(jìn)