轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因植物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、Bt殺蟲(chóng)基因是目前應(yīng)用得最為廣泛和最有潛力的一個(gè)抗蟲(chóng)基因,在蟲(chóng)害的防治中起到越來(lái)越重要的作用.目前獲得的轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因植物已達(dá)近70種,而新的Bt殺蟲(chóng)基因仍在不斷的被分離和鑒定,使得轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因植物的研究持續(xù)、高速發(fā)展,因此急需找到一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法.該研究以目前抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因育種中研究最多的Bt CryI A(C)基因的表達(dá)產(chǎn)物為檢測(cè)目標(biāo),在提取出高純度抗原并制備出高特異性抗體的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)研究了兩種載體上三種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)

2、定方法的檢測(cè)靈敏度,初步建立起快速、準(zhǔn)確的酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù).研究結(jié)果如下:一.采用多種生化技術(shù)提取蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)晶體蛋白,制備出了高純度的抗原.首先用堿液(50mM Na2CO3,50mM EDTA,3﹪巰基乙醇)裂解孢晶混合物,調(diào)節(jié)PH至等電點(diǎn)沉淀出晶體殺蟲(chóng)蛋白,再用聚丙烯酰胺凝膠制備電泳進(jìn)一步純化粗提的殺蟲(chóng)晶體蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示只有一條帶,說(shuō)明獲得的分子量約為130KD的殺蟲(chóng)晶體蛋白達(dá)到了電泳純,為制備特異性

3、抗體提供了條件保障.二.制備出了高特異性的Bt殺蟲(chóng)蛋白抗體和高質(zhì)量的酶標(biāo)抗體.用純化的Bt殺蟲(chóng)蛋白作為抗原免疫白兔,獲得了高特異性的抗血清,再經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和DEAE-52柱層析純化,提取出了較純的IgG.采用改良的過(guò)碘酸鈉法,用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG制備出了克分子比為2、工作濃度為1:800的高質(zhì)量酶標(biāo)抗體.為建立高靈敏度的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ).三.比較了兩種載體上三種酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的靈敏度,初步建立起檢測(cè)Bt殺蟲(chóng)蛋白的高靈

4、敏度方法.在聚苯乙烯酶標(biāo)板上的測(cè)定結(jié)果表明:直接ELISA和夾心ELISA的靈敏度相同,都為0.94ng/孔,但直接ELISA中抗原濃度與OD值間的線性關(guān)系呈極顯著,夾心ELISA中抗原濃度與OD值間的線性關(guān)系呈顯著;間接ELISA的靈敏度較前兩者低,使用HRP-IgG的靈敏度為15ng/孔,抗原濃度與OD值間的線性關(guān)系呈顯著,使用AKP-IgG的靈敏度為3.75ng/孔,抗原濃度與OD值間的線性關(guān)系呈極顯著.在硝酸纖維素膜上的測(cè)定結(jié)果