蛇床子素預(yù)處理對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷（AKI）是臨床常見(jiàn)的綜合征，最主要的原因是急性腎臟缺血。腎臟缺血再灌注損傷（IRI）是缺血性AKI主要的病理生理變化之一，也是移植排斥反應(yīng)，尤其是慢性排斥反應(yīng)的重要原因。臨床上常見(jiàn)于彌散性血管內(nèi)凝血、失血或中毒性休克、腎部分切除、腎實(shí)質(zhì)切開(kāi)取石等手術(shù)過(guò)程中。一系列研究資料表明，腎臟缺血再灌注損傷是由多個(gè)途徑、多個(gè)方面所介導(dǎo)動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程，其發(fā)生主要與炎癥、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、大量氧自由基的生產(chǎn)、凋亡基因調(diào)控等有關(guān)，是多種因素共同作用

2、引發(fā)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，炎癥是其核心。急性缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，因此，積極探討和研究缺血再灌注引起的急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制與防治，有助于為臨床上急性腎損傷的管理和治療提供理論和實(shí)踐依據(jù)。蛇床子素是草本植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，其主要藥理活性成分是香豆素類化合物，具有抗炎作用，還可影響鈉鉀ATP酶活性，兼有鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛、抗骨質(zhì)疏松及抗過(guò)敏、抗腫瘤等作用。目前的研究表明，蛇床子素能調(diào)節(jié) PI3K/Akt信號(hào)通路，減輕腦、心臟和

3、小腸等缺血再灌注，但在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在探討蛇床子素預(yù)處理在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及可能機(jī)制，期望為臨床上腎臟缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)及策略，為蛇床子素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　第一部分大鼠腎臟缺血再灌注模型的建立
　　目的：腎臟缺血再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的引起 AKI的主要病因。本文主要探討大鼠腎臟缺血再灌注模型的建立，選擇缺血再灌注損傷最典型的時(shí)間點(diǎn)，作為后續(xù)試

4、驗(yàn)的基礎(chǔ)。
　　方法：體重為200-250g的 SD雄性大鼠腹腔注射1％戊巴比妥鈉（65mg/kg）麻醉，溫度維持在38±1℃。剖腹，切除右腎，分離腎蒂，用非創(chuàng)傷性微血管夾夾閉左腎動(dòng)脈，誘導(dǎo)缺血45分鐘，移除動(dòng)脈夾允許再灌注12或24小時(shí)。Sham組只進(jìn)行剖腹探查術(shù)，并不誘導(dǎo)IRI。所有組的大鼠在開(kāi)始再灌注后迅速進(jìn)行腹部切口的縫合。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集血液標(biāo)本及腎臟組織，用于檢測(cè)血肌酐、尿素氮，并進(jìn)行腎臟組織切片， PAS病理

5、染色。
　　結(jié)果：隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)（12h，24h），血清肌酐和尿素氮的水平顯著上升，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PAS染色提示，24h時(shí)大鼠腎小管出現(xiàn)典型的AKI病變，造模成功。
　　結(jié)論：缺血后再灌注時(shí)間越長(zhǎng)，腎臟損傷越重，損傷呈時(shí)間依賴性，再灌注24h為最佳的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。
　　第二部分蛇床子素預(yù)處理減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷
　　目的：探討蛇床子素預(yù)處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　方法：體重為2

6、00-250g的 SD雄性大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（65mg/kg）麻醉，剖腹，切除右腎，誘導(dǎo)左腎缺血45分鐘，再灌注24小時(shí)建立腎臟缺血再灌注損傷模型。Osthole組以40 mg/kg的劑量在手術(shù)前45 min進(jìn)行腹腔注射進(jìn)行預(yù)處理。Sham組只進(jìn)行剖腹探查術(shù)，并不誘導(dǎo)IRI。所有組的大鼠在開(kāi)始再灌注后迅速進(jìn)行腹部切口的縫合。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集血液及腎臟組織。用于檢測(cè)血尿素氮、肌酐，并進(jìn)行PAS病理染色以及MPO免疫組化。<

7、br>　　結(jié)果：腎缺血再灌注以后，血清肌酐和尿素氮水平顯著上升、出現(xiàn)典型的AKI病理學(xué)改變，MPO表達(dá)明顯增加，蛇床子素預(yù)處理能顯著減輕上述改變。
　　結(jié)論：蛇床子素預(yù)處理能減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。
　　第三部分蛇床子素預(yù)處理減輕腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制
　　目的：腎臟缺血再灌注損傷具體發(fā)生機(jī)制涉及到炎癥、氧化應(yīng)激和腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。蛇床子素是天然的香豆素衍生物，具有潛在的抗炎作用。本研究旨在探討蛇床子素預(yù)處理

8、減輕腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　方法：隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為以下四組：假手術(shù)組（sham）、缺血再灌注損傷組（IRI）、蛇床子素預(yù)處理組（Osthole）、PDTC+蛇床子素預(yù)處理組（PDTC+Osthole）。SD雄性大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（65mg/kg）麻醉，剖腹，右腎切除，左側(cè)腎動(dòng)脈夾閉45min，隨后再灌注24h建立腎臟缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。在手術(shù)前45min預(yù)先腹腔注射蛇床子素，劑量為40mg/kg，PDTC+O

9、sthole組在手術(shù)前45min預(yù)先腹腔注射蛇床子素，劑量為40mg/kg，同時(shí)注入PDTC，劑量為100mg/kg。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集大鼠的血液和腎臟標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用RT-PCR和ELISA檢測(cè)腎組織和血清中TNF-α，IL-8和IL-6的表達(dá)，采用Western Blot檢測(cè)腎組織中p-p85（磷酸化的p85）， p85，p-Akt（磷酸化的Akt）， Akt， p65和p-p65(磷酸化的p65）的表達(dá)，采用TUNEL

10、和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和Active-Caspase3的表達(dá)。
　　結(jié)果：蛇床子預(yù)處理能顯著改善缺血再灌注損傷后腎功能和腎臟病理的變化，抑制 NF-κB的激活及 TNF-α， IL-8和 IL-6的表達(dá)，上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)，減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：蛇床子預(yù)處理能夠通過(guò)激活 PI3K/Akt信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB的激活，導(dǎo)致促炎因子TNF-α, IL-8和IL-6的表