基于DNA自組裝技術(shù)的microRNA傳感新方法研究.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）參與細(xì)胞生長(zhǎng)的一系列重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡及死亡等過程。miRNAs表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞的過度生長(zhǎng)、增殖及分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此，其作為一種潛在的新型核酸類腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。現(xiàn)有miRNA檢測(cè)方法主要有RT-PCR，微陣列芯片及Northern blot等，雖然這些方法都有一定的優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足，如操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低等，這些都會(huì)在很大

2、程度上影響其臨床實(shí)用性。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、實(shí)用、快速、靈敏的 miRNAs檢測(cè)技術(shù)對(duì)于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物，腫瘤的早期診斷和治療，探尋新的腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值；有助于實(shí)現(xiàn) miRNAs標(biāo)志物在腫瘤臨床診療中的應(yīng)用。本論文整合分子生物學(xué)、臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)及生物分析化學(xué)等學(xué)科的最新研究成果，基于功能核酸、DNA自組裝和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，構(gòu)建兩種新穎、簡(jiǎn)單、快速的 miRNAs傳感檢測(cè)新方法，為腫瘤標(biāo)志物的早期診斷與治療提

3、供潛在的檢測(cè)平臺(tái)。本研究主要包括以下兩個(gè)部分：
　　1.核酸信號(hào)放大策略用于miRNA的比色傳感
　　整合鏈替代聚合反應(yīng)和啞鈴狀密封探針介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增雙重信號(hào)放大策略，本研究構(gòu)建了一個(gè)快速、免標(biāo)記的比色傳感器用于miRNA的高靈敏、高特異性檢測(cè)。該傳感器主要包括4個(gè)組成部分，分別是由trigger模板、C-rich DNA修飾的MB，啞鈴狀滾環(huán)模板，剪切酶以及聚合酶。靶miRNA引發(fā)鏈替代聚合反應(yīng)，釋放滾環(huán)模板引物以啟動(dòng)基于

4、toehold的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，從而擴(kuò)增出大量富G的DNA（GDNA）序列；GDNA序列與Hemin結(jié)合形成DNAzyme催化ABTS2-和H2O2進(jìn)行比色反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) miRNAs的高靈敏、高特異性檢測(cè)。該方法檢測(cè)限低至10 aM，檢測(cè)線性范圍為10 aM~1 nM，能很好的應(yīng)用于實(shí)際樣本的檢測(cè)。本章所構(gòu)建的miRNA超靈敏檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、實(shí)用，有望成為腫瘤相關(guān)核酸標(biāo)志物的篩選、臨床診斷應(yīng)用的有力工具。
　　2.新型DNA納米鑷

5、的設(shè)計(jì)及其多組份miRNA的同時(shí)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
　　本方法構(gòu)建了一種基于靶物質(zhì)誘導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)變化的新型 DNA納米鑷，通過結(jié)合催化莖環(huán)自組裝（CHA）和鄰位觸及形成辣根過氧化物酶模擬酶（DNAzyme），實(shí)現(xiàn)了AND邏輯門操作和對(duì)多組份miRNA的同時(shí)檢測(cè)。本研究構(gòu)建的基于DX（DNA double crossover, DX）模塊的DNA納米鑷的包含有信號(hào)輸入和信號(hào)輸出結(jié)構(gòu)，兩臂中間含弓形結(jié)構(gòu)的DNA雙股螺旋作為信號(hào)輸入的識(shí)別域，用

6、于同時(shí)特異性甄別兩種不同的靶物質(zhì)；兩臂末端的拆分富G序列用于信號(hào)輸出。利用CHA信號(hào)放大策略，少量的靶物質(zhì)輸入可以靶向誘導(dǎo)大量的DNA納米鑷有打開狀態(tài)轉(zhuǎn)向閉合狀態(tài)，在Hemin存在時(shí)，鑷兩臂末端的拆分富G序列在鄰位觸及作用下形成大量 DNAzyme，從而產(chǎn)生放大的傳感輸出信號(hào)。兩種靶物質(zhì)通過AND邏輯門誘導(dǎo)調(diào)控DNA納米鑷的開關(guān)，通過聚丙烯酰胺電泳（PAGE）、表面等離子體共振（SPR）表征了該調(diào)控機(jī)制，證實(shí)新型DNA納米鑷構(gòu)建成功。構(gòu)