克雷伯氏菌噬菌體P13基因組學(xué)及多糖解聚酶性質(zhì)的研究.pdf

1、噬菌體是一類侵染細(xì)菌的病毒，廣泛存在于自然環(huán)境中，凡是細(xì)菌存在的地方都可以發(fā)現(xiàn)噬菌體，而目前已分離并研究的噬菌體并不多，截至2013年2月初，EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中僅收錄了1178種噬菌體的基因組序列。噬菌體個(gè)體較小，使得其基因組測(cè)序和功能基因組學(xué)研究都相對(duì)容易。進(jìn)行噬菌體基因組學(xué)的研究，對(duì)深入探討生物多樣性、基因調(diào)控、生長(zhǎng)代謝等許多生命現(xiàn)象都具有重大意義。
　　本文以克雷伯氏菌噬菌體P13為研究對(duì)象，對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)及基因組情況進(jìn)行了描述

2、。其一步生長(zhǎng)曲線顯示出，噬菌體P13潛伏期約為20min，爆發(fā)期約為40min，屬于烈性噬菌體。形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其頭部直徑約為50nm，并具有較短的尾部。采用高通量測(cè)序法對(duì)其基因組序列進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)基因組長(zhǎng)度為45976bp，為線性雙鏈DNA。
　　對(duì)噬菌體P13基因組的生物信息學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在P13基因組中共具有282個(gè)長(zhǎng)度大于100bp的ORFs，其中有50個(gè)ORFs為假定基因，基因總長(zhǎng)度為41329bp，基因平均長(zhǎng)度為833

3、bp。在50個(gè)假定基因中，有41個(gè)基因可找到同源性序列，其中25個(gè)基因已確定了功能，13個(gè)基因中存在高度保守的序列。通過(guò)對(duì)每個(gè)假定基因及整個(gè)基因組序列的同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)噬菌體P13與同屬于SP6-like屬的五種噬菌體相似度極高，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定噬菌體P13屬于短尾噬菌體科，Autographivirinae亞科，SP6-like virus屬噬菌體。
　　噬菌體P13基因組中存在著了大量的重復(fù)序列，這些序列可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、

4、DNA重組及基因組進(jìn)化有關(guān)。在RNA聚合酶基因及主要衣殼蛋白基因上、下游的非編碼區(qū)皆分別存在啟動(dòng)子及終止子結(jié)構(gòu)，證明這兩種蛋白可獨(dú)立快速表達(dá)，是噬菌體整個(gè)生命活動(dòng)中表達(dá)量最多也是最重要的兩種成分。此外，有多組基因間存在重疊現(xiàn)象，其中基因30(噬菌體頭尾連接病毒)與基因31(假定腳手架蛋白)，基因33(尾管蛋白A)與基因34(尾管蛋白)，基因40(末端小亞基蛋白)與基因41(末端大亞基蛋白)之間僅存在1個(gè)堿基重疊，這與色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)十

5、分相似，主要功能是使相鄰的兩個(gè)基因能夠高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)成對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，且保證產(chǎn)物在數(shù)量上相同，以利于協(xié)同發(fā)揮生物作用。噬菌體P13的C+G含量稍低于宿主菌的，兩者密碼子偏嗜性也存在很多相同之處，說(shuō)明噬菌體P13進(jìn)入克雷伯氏菌體內(nèi)寄生的歷史較久遠(yuǎn)。
　　噬菌體P13在侵染其宿主菌克雷伯氏菌K13時(shí)能夠產(chǎn)生一種熱穩(wěn)定良好的多糖解聚酶，作用是除去宿主表面的多糖，從而使其與細(xì)菌細(xì)胞壁接觸，完成常規(guī)的裂解循環(huán)。鑒于多糖解聚酶的水解性質(zhì)，可將其廣

6、泛應(yīng)用于生物膜降解、活性寡糖制備、多糖結(jié)構(gòu)分析及醫(yī)療等方面。本文對(duì)多糖解聚酶純化過(guò)程中酶活、噬菌體效價(jià)的變化進(jìn)行了研究。從220mL噬菌體P13原液中提取多糖解聚酶，經(jīng)過(guò)丙酮沉淀蛋白、粗酶液透析及超濾離心一系列純化步驟后，可制備出總酶活為27.5U的純酶。結(jié)合P13基因組中50個(gè)假定基因的功能情況，及SP6-like viruses屬噬菌體基因組的共同結(jié)構(gòu)特征，推斷出基因49及基因50為可能的多糖解聚酶基因。基于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，已成