OECs上清液誘導NSCs分化前后膜蛋白質(zhì)復合物的差異表達研究.pdf

1、第一章OECs培養(yǎng)及上清液對NSCs的誘導分化研究
　　 目的：探索小鼠嗅鞘細胞(olfactoryensheathingcells，OECs)對神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)分化的影響。
　　 方法：健康新生昆明小鼠10只，取大腦皮層組織，用含2％B27、1％N2、20ng/ml堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)和20ng/ml表皮生長因子(e

2、pidermalgrowthfactor，EGF)的培養(yǎng)液對NSCs進行懸浮培養(yǎng)，每5-7天傳代一次，純化培養(yǎng)2-3代備用，免疫細胞化學法對NSCs進行巢蛋白(Nestin)鑒定；取新生昆明小鼠嗅球，0.25%的胰蛋白酶37℃消化，改良Nash差速貼壁培養(yǎng)，加阿糖胞苷抑制雜細胞生長，當細胞數(shù)量達到大約80%時吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無血清DMEM)，反復沖洗3遍，收集條件培養(yǎng)液，每隔3天半量換液。-20℃保存條件培養(yǎng)液，免疫細胞化學法

3、對OECs進行神經(jīng)生長因子受體p75(nervegrowthfactorreceptorp75，NGFRp75)鑒定；實驗組NSCs加OECs條件培養(yǎng)液及無血清DMEM/F12液培養(yǎng)，對照組NSCs只加無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3天換液。觀察細胞生長及分化情況，神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF200)鑒定神經(jīng)元，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)鑒定

4、膠質(zhì)細胞。
　　 結(jié)果：新生昆明小鼠大腦皮層中分離培養(yǎng)出NSCs，這些細胞具有長期增殖能力，免疫細胞化學鑒定顯示Nestin染色陽性；新生昆明小鼠嗅球培養(yǎng)出OECs，7天NGFRp75染色見大量陽性細胞；對照組NSCs克隆球少部分貼壁，未見增殖分化，細胞逐漸萎縮，12天時細胞死亡，實驗組2天后NSCs克隆球開始貼壁分化，7天時分化較明顯，10天時免疫細胞化學染色，NF200染色顯示NSCs克隆球大部分分化為神經(jīng)元，GFAP染色顯

5、示NSCs克隆球少部分分化為膠質(zhì)細胞。
　　 結(jié)論：OECs上清液能誘導NSCs向神經(jīng)元方向分化。
　　 第二章C17.2神經(jīng)干細胞膜蛋白質(zhì)復合物的研究
　　 目的：探索小鼠嗅鞘細胞(olfactoryensheathingcells，OECs)上清液誘導神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)向神經(jīng)細胞分化的分子機制，篩選出誘導分化的關鍵蛋白，為臨床藥物靶向治療神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。
　　

6、 方法：取新生昆明小鼠嗅球，0.25%的胰蛋白酶37℃消化，改良Nash差速貼壁培養(yǎng)，加阿糖胞苷抑制雜細胞生長，當細胞數(shù)量達到大約80%時吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無血清DMEM)，反復沖洗3遍，收集條件培養(yǎng)液，每隔3天半量換液，-20℃保存條件培養(yǎng)液。免疫細胞化學法對OECs進行神經(jīng)生長因子受體p75(nervegrowthfactorreceptorp75，NGFRp75)鑒定。C172.2小鼠神經(jīng)干細胞系復蘇、培養(yǎng)、傳代，37℃快

7、速融化、離心、吹勻，高糖改良Eagle培養(yǎng)基H-DMEM(含15%胎牛血清)培養(yǎng)，4-5天傳代一次，擴增至第三代(P3)備用。實驗組NSCs加OECs條件培養(yǎng)液及無血清DMEM液培養(yǎng)誘導分化1/2、1、4小時，對照組NSCs只加無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。應用超速離心法提取細胞膜，藍綠溫和膠凝膠電泳(BlueNative-PAGE，BN-PAGE)分離膜蛋白質(zhì)復合物，膠內(nèi)酶切差異蛋白點，電噴霧四級桿時間飛行質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)

8、鑒定各時間點之間差異蛋白質(zhì)復合物的表達。將儀器自動產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件用Mascot軟件(www.matrixscience.com)中的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫搜尋(MS/MsIonSearch)功能進行搜索。
　　 結(jié)果：新生小鼠嗅球培養(yǎng)出OECs，7天NGFRp75染色見大量陽性細胞；C17.2NSCs復蘇后1天內(nèi)可見細胞貼壁生長，培養(yǎng)4-5天后細胞大量生長，進行傳代，傳代2天后可見大量細胞，形態(tài)呈梭形，折光性強；BN-PAGE顯示出11

9、個條帶，每個時間點膠條酶切這11個條帶。ESI-Q-TOF-MS鑒定到79個肽段相匹配的蛋白質(zhì)，其中53個蛋白有顯著差別的表達，另外26個蛋白有相同豐度的表達。我們共鑒定到5個蛋白質(zhì)復合物的差異表達。
　　 結(jié)論：1.OECs上清液誘導NSCs分化前期的4個時間點間膜蛋白質(zhì)復合物的表達有差異；
　　 2.我們發(fā)現(xiàn)5個差異蛋白質(zhì)復合物：mRNPgranulecomplex、ATPsynthasecomplex、eukary