極細(xì)鏈格孢菌功能基因HIS3及LEU2的初步研究.pdf

1、極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)是一種植物病原真菌，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害巨大，然而其在生防、環(huán)保等方面也有應(yīng)用，因此從分子水平研究該菌的功能基因的調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用該菌具有重要意義。在真核微生物的遺傳學(xué)研究中LEU2和HIS3基因是重要的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記，通過遺傳學(xué)手段，我們篩選獲得了極細(xì)鏈格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因，并且研究了AtLEU2及AtHIS3基因互補(bǔ)釀酒酵母的功能。以G418抗性基因作為選擇標(biāo)記，

2、構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的質(zhì)粒，建立了極細(xì)鏈格孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究AtLEU2及AtHIS3基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下： 1、將極細(xì)鏈格孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母LEU2缺失突變株，用SD-LEU培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得了3個(gè)正常生長(zhǎng)的酵母轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列均與酵母LEU2(ScLEU2)基因編碼的363個(gè)氨基酸同源(命名為

3、AtLEU2，其編碼的蛋白質(zhì)命名為Atleu2p)，該基因編碼的蛋白與植物病原菌小麥穎枯病CAB72262；灰葡萄孢霉EDN21270；玉蜀黍赤XP_386851，以及水稻稻瘟病病菌XP367617所編碼的β-蘋果酸脫氫酶同源，相似性分別達(dá)到94％、74％、1％和69％，與釀酒酵母、粗糙鏈孢霉EAA33847相似性為70％和63％。 2、將極細(xì)鏈格孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母HIS3缺失突變株，在SD-HIS培養(yǎng)基上篩選，獲得

4、了2個(gè)正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。所得基因的開放閱讀框(ORF)含有717個(gè)堿基，編碼238個(gè)氨基酸，與酵母HIS3(ScHIS3)基因同源(命名為AtHIS3，其編碼的蛋白質(zhì)命名為AtHis3p)，AtHis3p與植物病原真菌鏈格孢BAF69039，小麥穎枯病EAT83561，灰葡萄孢霉EDN23196，玉蜀黍赤霉XP_386269，以及水稻稻瘟病病菌XP367617中編碼的咪唑甘油磷酸脫水酶同源，相似性分別達(dá)到100％，90％，68％，65％

5、和63％；與生防菌哈茨木霉P34041相似性達(dá)64％；與釀酒酵母，粗糙鏈孢霉XP961386編碼的蛋白相似性達(dá)64％和66％。 3、分別選擇以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500bp左右作為同源臂，在上游同源序列3’端連接(3418抗性基因(以保證缺失突變株的檢測(cè)及鑒定)，構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的質(zhì)粒，為在極細(xì)鏈格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研