IL-6通過JAK2-STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　由于腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)具有價(jià)格較低、操作簡(jiǎn)單方便、對(duì)患者生活方式影響少、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響小、交叉感染率低、可以更好的保護(hù)殘余腎功能等優(yōu)點(diǎn)，已成為越來越多ESRD患者首選的RRT方式。隨著PD廣泛應(yīng)用和相關(guān)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)隨著患者PD時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜透析液的高滲透壓、低 PH值、葡萄糖降解產(chǎn)物等生物不相容因素及反復(fù)發(fā)作的腹膜炎，將引起腹膜形態(tài)和功能的改變，最終引起腹膜纖維化

2、(Peritoneal fibrosis,PF)，導(dǎo)致超濾衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)的發(fā)生率逐漸增加。
　　在IL-6與腹膜透析相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)血漿IL-6的濃度在急性期反應(yīng)時(shí)增加，并與血液透析和PD患者的死亡率相關(guān)。由于IL-6在PD透出液中的濃度超過其在血漿中的濃度，表明在PD的過程中，局部的腹膜腔可以產(chǎn)生IL-6。有研究顯示，PD治療第一年就可以觀察到PD患者腹腔和全身炎癥反應(yīng)的增加，且

3、腹腔和全身的炎癥反應(yīng)與IL-6可能是相互關(guān)聯(lián)的，PD透出液中IL-6的濃度與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率呈線性增加關(guān)系。IL-6在透出液中的濃聚是腹腔局部炎癥的標(biāo)志，且在腹膜炎時(shí)明顯升高。
　　JAK/STAT信號(hào)通路維持人體內(nèi)的多種生理過程，并同時(shí)參與多種病理過程，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，是一種重要的介導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路。在癌癥疾病的研究中，JAK/STAT信號(hào)通路已成為腫瘤治療的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)多種人類腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、結(jié)直

4、腸癌、乳腺癌等存在異?；罨癄顟B(tài)的STAT3。EMT是上皮細(xì)胞癌進(jìn)展過程中的重要事件，有研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3通路參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞之間的黏附過程，與惡性病變中細(xì)胞EMT有關(guān)。IL-6與細(xì)胞膜結(jié)合受體結(jié)合，從而激活JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實(shí)現(xiàn)IL-6反應(yīng)基因的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　本研究的目的在于探討IL-6誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）EMT的發(fā)生過程。在

5、不同濃度及不同作用時(shí)間的IL-6作用下，采用Western blot檢測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化狀態(tài)。使用信號(hào)通路抑制劑WP066，阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路后，觀察HPMCs細(xì)胞的EMT過程是否被阻斷，進(jìn)一步驗(yàn)證IL-6通過JAK2/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)HPMCs的EMT過程。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞，分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組。(I)正常對(duì)照組;(II)30 ng/mL IL-6作用組;(III

6、)50 ng/mL IL-6作用組;(IV)100 ng/mL IL-6作用組。培養(yǎng)5天后，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。
　　2.使用50 ng/mL IL-6作用人腹膜間皮細(xì)胞24h、48h、72h，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
　　3.設(shè)定3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為正常對(duì)照組，50 ng/mL IL-6組和100 ng/mL IL-6組，作用24h，熒光定量PCR檢測(cè)EMT標(biāo)記

7、物（上皮表型E-cadherin、纖維表型α-SMA和α-SMA）的mRNA表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)變化。
　　4.設(shè)定4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別使用50 ng/mL IL-6作用0h（正常對(duì)照組）、24h組、48h組、72h組，熒光定量PCR檢測(cè)EMT標(biāo)記物的mRNA表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)變化。
　　5.分組同3，Western blot檢測(cè)不同劑量IL-6作用24h，JAK2/

8、STAT3信號(hào)通路蛋白的活化狀態(tài)。
　　6.分組同4，Western blot檢測(cè)50 ng/mL IL-6作用不同時(shí)間，JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白的活化狀態(tài)。
　　7.分別設(shè)定0（正常對(duì)照組）,2,4,6,8 and10μM濃度的WP1066，作用時(shí)間持續(xù)24h，Western blot方法檢測(cè)各組 P-STAT3/STAT3的相對(duì)水平，得出WP1066的有效作用濃度。
　　8.使用WP1066阻斷JAK2/S

9、TAT3信號(hào)通路，Western blot方法檢測(cè)P-JAK2、JAK2、P-STAT3及STAT3的表達(dá)變化。
　　9.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路，熒光定量PCR檢測(cè)EMT標(biāo)記物的mRNA表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)變化。
　　10.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路，倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化。
　　結(jié)果
　　1.使用

10、中濃度(50ng/ml)及高濃度(100ng/ml)的IL-6外源性刺激HPMCs5天，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由多角形、鵝卵石樣的上皮樣細(xì)胞形態(tài)向梭形、扁平星樣的纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變，同時(shí)細(xì)胞間隙增寬、連接疏松，呈明顯纖維樣改變。
　　2.在MTT實(shí)驗(yàn)中，外源性使用50ng/ml的IL-6分別作用HPMCs24、48、72h，發(fā)現(xiàn)與同時(shí)間空白對(duì)照組相比，IL-6能夠明顯刺激HPMCs細(xì)胞增殖。
　　3.隨著IL-6作用濃度的增高，細(xì)胞上皮表

11、型E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平逐漸下降，纖維表型α-SMA和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)水平逐漸增高，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比，表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＊P<0.05）。
　　4.使用50ng/ml IL-6作用HPMCs不同時(shí)間（24、48、72h），發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，E-cadherin蛋白及和mRNA表達(dá)水平逐漸降低，相反的，上皮表型蛋白α-SMA和VEGF蛋白及和mRNA表達(dá)水平逐漸增高，與正常對(duì)照組相比，其

12、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　5.作用時(shí)間24h，隨著IL-6作用濃度的增高，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　6.IL-6作用濃度50ng/ml，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　7.Western blot結(jié)果顯示,當(dāng)WP1066的濃度為10μM時(shí)，與正常對(duì)照組

13、相比，P-STAT3表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P<0.05）。
　　8.使用WP1066阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表達(dá)水平較正常對(duì)照組無明顯變化，WP1066可阻斷IL-6誘導(dǎo)的JAK2/STAT3通路活化狀態(tài)。
　　9.阻斷HPMCs細(xì)胞中JAK2/STAT3通路活化后，上皮表型E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平，纖維表型α-SMA和VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平

14、，未發(fā)生明顯變化，與正常對(duì)照組及抑制劑對(duì)照組相比，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　10.阻斷HPMCs細(xì)胞中JAK2/STAT3通路活化后，細(xì)胞形態(tài)仍然呈多角形、鵝卵石樣，不再呈纖維樣改變。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖被減弱。
　　結(jié)論：
　　1.IL-6可誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生EMT，其標(biāo)記物的表達(dá)對(duì)IL-6有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　2.JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化對(duì)IL-6有劑量依賴性和時(shí)間