中國(guó)肝癌病人中四種p53突變體細(xì)胞功能的研究.pdf

1、肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最高發(fā)的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，肝癌的死亡率居第2位，僅次于肺癌。腫瘤抑制基因p53是研究最為廣泛的基因之一，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。50％以上的腫瘤中都存在有p53基因的突變。p53是細(xì)胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控因子之一，在發(fā)生細(xì)胞應(yīng)急或受損傷的情況時(shí)，p53能整合各種不同的細(xì)胞危急事件信號(hào)，通過轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄途徑對(duì)這些信號(hào)作出包括細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或凋亡在內(nèi)的不同反應(yīng)，以阻止遺

2、傳信息遭受破壞的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，阻止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性。因此該基因的突變及失活成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 前期研究采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，對(duì)202例中國(guó)肝癌病人的病理組織標(biāo)本進(jìn)行p53基因的全程突變檢測(cè)。在p53基因編碼區(qū)的11個(gè)外顯子中，檢測(cè)出涉及氨基酸改變的25種核苷酸突變。將檢測(cè)結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的中國(guó)肝癌中p53基因突變進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)所篩查到的25種突變中僅有2種R249S(AGG-AGT，A

3、GG-AGC)和V157F曾經(jīng)被報(bào)道過，其余的22種尚無報(bào)道。為探討p53突變與肝癌發(fā)生的關(guān)系，本研究根據(jù)所篩查到的突變，對(duì)在中國(guó)肝癌病人中未曾報(bào)道過的4種p53突變體C141Y、R156P、C176F、P191S進(jìn)行細(xì)胞功能方面的研究。本研究中，4種突變體的突變率均為0.459％。 首先從人肝cDNA文庫(kù)中克隆了野生型p53基因，利用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了4種真核表達(dá)載體pCMV-C141Y、pCMV-R156P、pCMV-C

4、176F、pCMV-P191S，轉(zhuǎn)染p53缺陷型的H1299細(xì)胞系。Western Blot檢測(cè)表明，四種p53突變體在轉(zhuǎn)染量相等的情況下，蛋白表達(dá)量相當(dāng)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)四種突變體的轉(zhuǎn)錄活性研究結(jié)果表明：同野生型p53相比，C141Y、R156P、C176F對(duì)報(bào)告質(zhì)粒pP53-TA-Luc和p21啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活能力顯著下降，幾乎喪失轉(zhuǎn)錄激活作用，而P191S對(duì)報(bào)告質(zhì)粒pP53-TA-Lue的轉(zhuǎn)錄激活能力與同野生型p53相

5、當(dāng)，對(duì)p21啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活能力比野生型p53顯著增強(qiáng)，相對(duì)熒光強(qiáng)度約為野生型p53的2.5倍；流式細(xì)胞儀對(duì)四種突變體的凋亡檢測(cè)結(jié)果表明：突變體C141Y、R156P、C176的促凋亡能力顯著降低，突變體C141Y、R156P的凋亡細(xì)胞比例僅相當(dāng)于野生型p53的1/3，突變體C176F凋亡細(xì)胞比例相當(dāng)于野生型p53的2/3，突變體P191S的促凋亡能力與同野生型p53相當(dāng)。 本研究表明，4種p53突變體功能差異可能是由于突變本

6、身所致，而不是由于在細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的差異所引起的。有些突變會(huì)使p53作為轉(zhuǎn)錄因子的功能喪失，促凋亡能力下降如C141Y、R156P、C176F，而P191S突變對(duì)p53的轉(zhuǎn)錄活性和促凋亡能力沒有顯著影響。說明p53突變與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系除了與突變型p53轉(zhuǎn)錄活性及促凋亡能力下降有關(guān)外，還存在獨(dú)立于上述功能的其它模式。本研究首次大規(guī)模的對(duì)202例中國(guó)肝癌病人病理組織標(biāo)本的p53基因進(jìn)行全程突變檢測(cè)，所檢測(cè)的結(jié)果為世界范圍內(nèi)p53基因