耐熱β-葡萄糖苷酶細(xì)菌的篩選、基因的克隆與表達(dá).pdf

1、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase;EC.3.2.1.21)是纖維素酶系中一種重要的水解酶,在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。耐熱性β-葡萄糖苷酶具有加快反應(yīng)速率、降低能耗等優(yōu)勢(shì),在食品發(fā)酵、燃料乙醇等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文旨在探索一種能與糖化酶協(xié)同作用的耐熱性β-葡萄糖苷酶,以達(dá)到提高淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程中的原料利用率和出酒率的目的。
　　 本文首先通過(guò)篩選獲得了1株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)的嗜熱細(xì)

2、菌(F157043A),經(jīng)過(guò)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定、形態(tài)分析以及生理生化鑒定,確定該菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),進(jìn)一步對(duì)該菌的粗酶液進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析,并將β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了克隆表達(dá)。
　　 1.從中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心(CICIM-CU)菌種庫(kù)中的1323株細(xì)菌保藏物中篩選出20株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌;通過(guò)16S rDNA序列鑒定,初步確

3、定其中5株為嗜熱溶胞土芽孢桿菌(Geobacillus sp.),其余為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis);進(jìn)一步復(fù)篩獲得兩株產(chǎn)酶能力較優(yōu)的細(xì)菌(編號(hào)為170-28-2的嗜熱溶胞桿菌與編號(hào)為F157043A的地衣芽孢桿菌)并對(duì)其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的分析;選取具有較好耐熱性與較寬pH耐受性的F157043A菌株作進(jìn)一步的研究。
　　 2.通過(guò)對(duì)編號(hào)為F157043A的細(xì)菌進(jìn)行菌體和菌落形

4、態(tài)觀察以及生理生化特征分析,進(jìn)一步鑒定該菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
　　 3.對(duì)該菌β-葡萄糖苷酶的粗酶液酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn):該酶最適反應(yīng)溫度為55℃,在60℃酶活力保持在80％以上;最適反應(yīng)pH值為9.0,在pH為6.0～9.0范圍內(nèi)酶比較穩(wěn)定;木糖、葡萄糖、果糖對(duì)該酶的酶活力有明顯的抑制作用;Cu2+、Zn2+、Ca2+、SDS對(duì)酶活力有很強(qiáng)的抑制作用,Mg2+、Co2+、Mn2+對(duì)酶活

5、力有明顯的激活作用;不同濃度的酒精對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用。
　　 4.以地衣芽孢桿菌F157043A的染色體為模板PCR擴(kuò)增獲得1410bp的β-葡萄糖苷酶基因(bglH),將該片段連接至表達(dá)載體pET-20b(+)中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組子;重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,在SDS-PAGE上檢測(cè)到約53 kDa的重組蛋白條帶;在60℃條件下重組菌粗酶液比酶活為0.14 U/mg,對(duì)照菌粗酶液比酶活為0.0