血小板衍生因子對(duì)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞TRPC6的調(diào)控.pdf

1、前言:
　　膀胱過(guò)度活動(dòng)癥是泌尿外科一種常見(jiàn)疾病。以尿急癥狀為特征的綜合征，常伴有尿頻和夜尿癥狀，可伴或不伴有急迫性尿失禁。美國(guó)目前有17％的成人患有膀胱過(guò)度活動(dòng)癥，其患病率隨著年齡上升而增加。膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的這些癥狀與膀胱逼尿肌功能異常有著密切關(guān)系。雖然目前關(guān)于膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的發(fā)病機(jī)制并不清楚，但是很多證據(jù)都表明與陽(yáng)離子通道異常有關(guān)，某些離子通道在調(diào)節(jié)逼尿肌收縮與放松有著重要作用。
　　瞬時(shí)受體電位通道是一組非選擇性金屬離

2、子通道，如Na+，Ca2+，Mg2+。TRP通道家族由TRPC，TRPN，TRPV，TRPM，TRPA，TRPP等組成。其中的Ca2+離子在細(xì)胞質(zhì)中有著重要作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca+濃度上升時(shí)會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的肌細(xì)胞收縮，反之放松。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TRPC通道在調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮中有著越來(lái)越多的重要作用。有報(bào)道稱TRPC1與TRPC4在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱功能異常中有著重要作用。但是關(guān)于TRPC6與膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的關(guān)系中目前鮮有報(bào)道。
　　血小板

3、衍生因子在膀胱受損修復(fù)中有著重要作用。血小板衍生因子有著潛在促進(jìn)膀胱平滑肌細(xì)胞有絲分裂，同時(shí)也有著調(diào)節(jié)輸尿管，三角區(qū)平滑肌細(xì)胞增殖作用。血小板衍生因子也能夠促進(jìn)受損膀胱平滑肌細(xì)胞增殖。在生理范圍內(nèi)，持續(xù)給予膀胱平滑肌細(xì)胞機(jī)械張力可以使血小板衍生因子及其受體的表達(dá)上升，這種現(xiàn)象可能也出現(xiàn)在出口梗阻引起膀胱壁纖維化過(guò)程中。這提示了在出口梗阻引起的膀胱過(guò)度活動(dòng)癥中，血小板衍生因子也可以影響著TRPC6的一些作用參與膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的發(fā)生發(fā)展。<

4、br>　　血小板衍生因子的大多作用也都與絲裂原活化蛋白激酶通路有關(guān)。血小板衍生因子可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路誘導(dǎo)多種細(xì)胞有絲分裂、增殖和分化。血小板衍生因子同樣可以在呼吸道平滑肌細(xì)胞中促進(jìn)TRPC6的表達(dá)。目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在膀胱平滑肌細(xì)胞中血小板衍生因子可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路來(lái)調(diào)控TRPC6的報(bào)道。因此我們?cè)诎螂灼交〖?xì)胞中檢測(cè)了血小板衍生因子對(duì)TRPC6的調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)

5、>　　培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2，培養(yǎng)基成分:DMEM:/F12并且含有10％胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常情況下每2天換液一次，每4天可進(jìn)行傳代操作。
　　2、Western Blot
　　細(xì)胞加入50-80ul1.25X Lysis Buffer。適當(dāng)抽吸，使原來(lái)沉底的細(xì)胞與裂解液充分混合。離心20分鐘。取上清液即為細(xì)胞總蛋白。電泳及轉(zhuǎn)膜，使用蛋白定量試劑盒測(cè)定每組蛋白濃度，配平后上樣，電泳時(shí)間為100

6、min，恒壓120v。電泳結(jié)束開(kāi)始轉(zhuǎn)膜，TRPC6轉(zhuǎn)膜條件120mA，100min，β-actin為100mA，60分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后漂洗PVDF膜，5min/次，4次。封閉，TRPC6使用含有5％BSA的TBST封閉70分鐘，β-actin使用含有5％脫脂奶粉的TBST封閉100分鐘。將TRPC6一抗按照1∶500稀釋到工作濃度，將β-actin按照1∶2000稀釋到工作濃度。置于旋轉(zhuǎn)搖床上，室溫25℃孵育4小時(shí)。然后洗滌PVDF膜，5

7、min/次，4次。開(kāi)始孵育二抗，使用1∶2000將二抗稀釋到工作濃度，室溫25℃孵育1小時(shí)后洗滌PVDF膜，5min/次，4次。準(zhǔn)備發(fā)光。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　使用血小板衍生因子處理大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞后24小時(shí)后可以發(fā)現(xiàn)明顯的濃度梯度差異。同樣在時(shí)間依賴曲線中，使用30ng/ml血小板衍生因子處理細(xì)胞后，可以發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)間組TRPC6蛋白濃度差異。表明血小板衍生因子可以增加大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞中TRPC6的表達(dá)。
　　

8、這兩個(gè)通路都參與了血小板衍生因子調(diào)控TRPC6的表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)即使在無(wú)血小板衍生因子刺激的條件下，單純抑制p38信號(hào)通路與JNK信號(hào)通路也能減少TRPC6蛋白的表達(dá)。
　　我們使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子處理大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞24小時(shí)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組TRPC6蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，但是實(shí)驗(yàn)組卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的一個(gè)濃度梯度變化。
　　結(jié)論:
　　1、血小板衍生因子可以增加大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞中TRPC6的表達(dá)。
　　2、絲裂原活