肺結(jié)核X染色體易感基因及全基因組關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、結(jié)核分支桿菌（M.tuberculosis）引起的肺結(jié)核(pTB)是世界上最致命的傳染性疾病之一。近年來，由于耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病(TB)的發(fā)病率和死亡率一直保持很高，其中死亡率高于其他任何單一傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的2014年年度調(diào)查，在2012年，結(jié)核病患者總數(shù)約有860萬人，其中約66％（570萬）為新發(fā)病例，而同年死于結(jié)核病的人數(shù)約為130萬病，其中32萬人死亡時艾滋病病毒(HIV)呈陽性。中國是22個高負(fù)擔(dān)肺結(jié)核

2、病國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量僅次于印度，居世界第二位。
　　雖然約1/3的世界人口感染了結(jié)核分枝桿菌，但其中只有10％發(fā)展為活動性肺結(jié)核，這說明個體對于肺結(jié)核具有不同的易感性。在這些患者中，除去有明顯危險因素（比如HIV感染、糖尿病和其他免疫缺陷狀態(tài)）的患者，剩下則是由于其他因素的影響，包括遺傳因素、環(huán)境因素以及相應(yīng)的相互作用等。人類中宿主遺傳因素在導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染和引起肺結(jié)核方面起到關(guān)鍵作用已經(jīng)得到國際公認(rèn)。
　　從19

3、83年開始，研究者為在人的基因組中篩選出肺結(jié)核病的易感基因而做出了大量的努力。眾多基于候選基因的結(jié)核病關(guān)聯(lián)研究對預(yù)測可能的功能性位點(diǎn)進(jìn)行了檢驗(yàn)，包括SLC11A1(NRAMP1)、HLA家族、Toll樣受體(TLR)家族的基因和屬于IFN-γ和IL-12信號通路的基因等。但是與其他疾病相比，結(jié)核病易感性的遺傳研究由于環(huán)境因素的復(fù)雜影響未能取得較大的成功。大多數(shù)報道出來的結(jié)核病相關(guān)位點(diǎn)不能在其他人群中得到驗(yàn)證。
　　全基因組關(guān)聯(lián)研究

4、（GWA研究，或GWAS），也被稱為全基因組關(guān)聯(lián)研究（WGA研究，或WGAS）或共變體關(guān)聯(lián)研究(CVAS)，是一種可以同時對大量個體檢測整個基因組的變異，以查看是否有變異與一個性狀相關(guān)聯(lián)。GWAS研究通常應(yīng)用在SNP位點(diǎn)與重大疾病之間的關(guān)聯(lián)。目前，針對非洲人群的兩個大型GWAS研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩個全基因組水平上的SNP位點(diǎn)。這個發(fā)現(xiàn)一定程度上提供了結(jié)核病的早期干預(yù)和治療線索。中國的結(jié)核病患者在世界占第二位，然而到現(xiàn)在為止，沒有研究關(guān)注于中

5、國漢族人群的結(jié)核病GWAS。
　　另一方面，大量數(shù)據(jù)表明，在接觸結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展成為結(jié)核病的人群中，約70％是男性，全世界范圍內(nèi)結(jié)核病患者的男女比例高達(dá)1.9±0.6，部分國家男性患者甚至達(dá)到女性患者的三倍以上。證據(jù)還表明，相對于女性患者，男性患者的結(jié)核病更加嚴(yán)重。雖然這個現(xiàn)象可能有一定的社會經(jīng)濟(jì)和文化因素，比如在發(fā)展中國家婦女由于不受重視而被忽略了部分病情，但是這種懸殊比例的性別特異性更多被認(rèn)為是由生物異質(zhì)性導(dǎo)致。這類生物因素

6、可能包括性別偏倚、性荷爾蒙、與性別有關(guān)的遺傳因素和新陳代謝特點(diǎn)。因此可以做出一個合理的假設(shè):宿主的遺傳變異，特別是在X染色體上免疫相關(guān)基因的某些變異可能有助于解釋結(jié)核病發(fā)病率的性別特異性。
　　第一部分肺結(jié)核全基因組關(guān)聯(lián)研究
　　目的:人類中宿主遺傳因素在導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染和引起肺結(jié)核方面起到關(guān)鍵作用已經(jīng)得到國際公認(rèn)。目前為止，基于病例對照的肺結(jié)核GWAS研究已經(jīng)在2個非洲人群（加納和岡比亞）發(fā)現(xiàn)了全基因組水平上的關(guān)聯(lián)SN

7、P位點(diǎn)，并且在另一個人群中得到了一定程度的驗(yàn)證。本課題的目標(biāo)是在中國漢族人群中用GWAS研究來全面評估遺傳位點(diǎn)和肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性。
　　對象和方法:為了在中國漢族人群中鑒定遺傳標(biāo)記，對500例肺結(jié)核病例和600例健康對照進(jìn)行全基因組基因分型。經(jīng)過了對每個樣本和位點(diǎn)的嚴(yán)格的質(zhì)量控制后，共有483例肺結(jié)核病例和587例健康對照的650，939個SNP保留并進(jìn)行下一步的統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用多維尺度模型(MDS)校正人群分層，并且使用前3個MDS

8、向量作為協(xié)變量用于之后的logistic回歸分析。接下來，使用千人基因組計(jì)劃(1000 Genomes Project)的數(shù)據(jù)對分型結(jié)果實(shí)施基因填補(bǔ)，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制后，共獲得了5，692，315個填補(bǔ)的SNP位點(diǎn)。為驗(yàn)證是否存在中國漢族人群和非洲人群的共同肺結(jié)核病易感位點(diǎn)，對本研究的中國漢族數(shù)據(jù)集與已經(jīng)發(fā)表的加納肺結(jié)核GWAS數(shù)據(jù)集（1359例病例，1952對照;793，694個分型的SNP位點(diǎn);5，426，380填補(bǔ)的SNP位點(diǎn)）

9、實(shí)施了meta分析?？傆?jì)共有1537個SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證階段的基因分型，驗(yàn)證階段的受試對象包括中國漢族1272例病例和1733例對照以及蒙古族121例病例和231例對照。
　　結(jié)果和結(jié)論:合并分析中國漢族人群的GWAS第一階段結(jié)果和兩個驗(yàn)證人群的結(jié)果后，SNP位點(diǎn)rs932347達(dá)到了全基因組水平的關(guān)聯(lián)(Padditive=1.45×10-9OR=0.69;95％ CI=0.61-0.78)。由于SNP位點(diǎn)rs932347在中國漢

10、族人群的次等位基因頻率為17％，而在加納人群中僅有1.5％，屬于罕見變異位點(diǎn)，因此未發(fā)現(xiàn)其在加納人群中表現(xiàn)出與肺結(jié)核病的關(guān)聯(lián)性。然而，由于部分加納人群的肺結(jié)核病例是由一種只發(fā)生在非洲的結(jié)核分枝桿菌(M.africanum)所感染，當(dāng)去除這一部分病例后，發(fā)現(xiàn)在SNP位點(diǎn)rs932347對于加納人群的同樣起到保護(hù)效果，OR值為0.84，這與在中國漢族人群和蒙古人群觀察到的結(jié)果方向一致。rs4331426和rs2057178這兩個在加納人群中

11、被確認(rèn)的肺結(jié)核易感性位點(diǎn)未在中國漢族人群中表現(xiàn)出任何關(guān)聯(lián)。同樣，認(rèn)為這個結(jié)果可部分歸結(jié)為不同人群中等位基因頻率的差別。rs4331426G和rs2057178A的等位基因頻率在中國漢族人群中僅為4％和5％，而在加納人群中分別為45％和32％?？傊?，通過一個三階段的全基因組關(guān)聯(lián)研究在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)了一個對肺結(jié)核病起保護(hù)作用的新的SNP位點(diǎn)。
　　第二部分肺結(jié)核X染色體易感基因病例對照研究
　　目的:在接觸結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展

12、成為結(jié)核病的人群中，約70％是男性，因此，宿主的遺傳變異，特別是X染色體上的免疫相關(guān)基因可能與結(jié)核病性別特異性相關(guān)聯(lián)。為了鑒定這個假設(shè)，選取X染色體的三個SNP位點(diǎn)(TLR8基因的rs3764880、CD40LG基因的rs3092923和IRAK1基因的rs3027898)，應(yīng)用病例對照研究設(shè)計(jì)，以確定在中國漢族人群中上述位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核病發(fā)病間的聯(lián)系。
　　對象和方法:共納入符合納入標(biāo)準(zhǔn)的1011例肺結(jié)核病例和1105例正常對

13、照，其中923例病例和1033例對照的樣本最終通過了測序平臺的樣本質(zhì)量檢測。肺結(jié)核病住院病例于2007年3月至2009年8月從河北省胸科醫(yī)院和石家莊市第五醫(yī)院收集。健康對照是從北京電力醫(yī)院進(jìn)行年度體檢的人群中選取。本研究方案已經(jīng)經(jīng)過河北省胸科醫(yī)院、石家莊市第五醫(yī)院和北京電力醫(yī)院倫理委員會的審核。在獲得所有病例組和對照組受試者的書面知情同意后，才進(jìn)行5ml全靜脈EDTA抗凝血液樣本的收集工作。應(yīng)用三種多重logistic回歸分析（男性和女

14、性的合并分析、男性單獨(dú)分析和女性單獨(dú)分析）分別對三個SNP位點(diǎn)的兩種遺傳模型（共顯性和隱性模型）進(jìn)行建模，并對年齡，性別，吸煙狀況和接種卡介苗等因素進(jìn)行校正。除此之外，應(yīng)用隱性遺傳模型的多重logistic回歸分析對男性和女性的合并數(shù)據(jù)進(jìn)行性別和SNP位點(diǎn)的交互作用分析。
　　結(jié)果和結(jié)論:在對三個位點(diǎn)分別進(jìn)行的含有位點(diǎn)與性別交互作用項(xiàng)隱性遺傳模型的多重Logistic回歸分析結(jié)果中，只有CD40LGrs3092923的交互作用項(xiàng)(

15、CT+ CC或C/(-)與性別）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重檢驗(yàn)校正后Pcorr=0.0213，OR男性[95％CI男性]=0.47[0.32-0.70]。由于該交互作用經(jīng)過了年齡、吸煙和卡介苗接種狀況因素的校正，消弱了這些非試驗(yàn)因素的影響，說明CD40LG rs3092923可能對肺結(jié)核病的性別特異性產(chǎn)生作用。而對于TLR8 rs3764880和IRAK1 rs3027898位點(diǎn)與性別的交互作用項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.5008和0.921

16、3）。CD40LGrs3092923以及它與另外兩個位點(diǎn)的聯(lián)合作用均只在男性中表現(xiàn)，在男性中，當(dāng)以野生型T/（-）作為參考時，C/(-)基因型對肺結(jié)核病表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用(OR=0.52，95％CI=0.35-0.78，Pcorr=0.0045)。若以沒有風(fēng)險等位基因的作為參照，隨著三個SNP位點(diǎn)推定的風(fēng)險等位基因累計(jì)數(shù)的增加，受試者中患肺結(jié)核病的風(fēng)險越來越大，呈逐級遞增的趨勢。其效果從有一個累計(jì)風(fēng)險等位基因時的OR=2.58，到有兩