H19-IGF2印跡模型中miR-483和miR-675功能研究.pdf

1、H19/Igf2(胰島素樣生長因子2，insulin-like growth factor2)印跡基因隸屬于一個基因印跡群，分別位于人染色體11P15.5，在進(jìn)化上具有高度的保守性。H19基因?yàn)槟冈葱杂≯E基因，而Igf2基因?yàn)楦冈葱杂≯E基因，兩者相距90kb，表達(dá)調(diào)控相關(guān)，對個體的生長、發(fā)育及行為發(fā)展有重要的作用。H19/Igf2印跡基因在基因結(jié)構(gòu)和類型上涉及到了編碼基因、非編碼基因、印跡基因、宿主基因、內(nèi)含子基因、microRNA基因

2、和反義基因，是研究基于RNA介導(dǎo)的遺傳信息表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式的最佳模型之一。
　　首先，為研究H19/Igf2印跡基因模型中miR-483、miR-675及其宿主基因Igf2、H19之間在不同遺傳背景、不同生理病理狀態(tài)下共同的表達(dá)模式和表達(dá)調(diào)控規(guī)律，我們選取各種不同的細(xì)胞系，同時利用不同實(shí)驗(yàn)手段，檢測分析上述各基因之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，建立其表達(dá)調(diào)控模型。其次，本研究同時關(guān)注了miR-483的靶基因的預(yù)測和篩選，篩選獲得了miR-48

3、3的一個靶基因-PDGFB(血小板來源的生長因子，platelet-derived growth factor beta polypeptide)，為下一步繼續(xù)研究miR-483的功能以及調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
　　取得的主要進(jìn)展有:
　　1.Igf2及H19基因除在少數(shù)細(xì)胞系中皆低表達(dá)外，在多數(shù)細(xì)胞系中其表達(dá)呈拮抗關(guān)系；而miR-483及miR-675在各細(xì)胞系中的表達(dá)與其宿主是協(xié)同一致的。結(jié)果顯示，Igf2基因在HEK-293T

4、、A549細(xì)胞中表達(dá)相對較高，而在HepG2、HeLa、HCC-Lm3及BEL-7402細(xì)胞中表達(dá)水平較低； H19基因在HepG2和HeLa、HCC-Lm3及BEL-7402細(xì)胞中表達(dá)相對較高，而在HEK-293T和A549細(xì)胞中表達(dá)水平較低；而在K562細(xì)胞中兩者皆低表達(dá)；miR-483及miR-675在各細(xì)胞系中的表達(dá)與其宿主是協(xié)同一致的。
　　2.miR-483很可能參與IGF2信號通路介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控。結(jié)果

5、顯示，Chromeceptin處理HEK-293T、A549和HepG2細(xì)胞6h后，IGF2與miR-483在各細(xì)胞中表達(dá)變化不一致，IGF2在各細(xì)胞中的表達(dá)水平無明顯變化，而miR-483則表達(dá)明顯下調(diào)。Chromeceptin很可能通過抑制IGF2信號通路抑制了miR-483的生成過程，從而使成熟miR-483的表達(dá)下調(diào)。
　　3.miR-483及miR-675表達(dá)會受其他因子的調(diào)控而與其宿主基因的表達(dá)不一致。結(jié)果顯示，CoC

6、l2誘導(dǎo)HepG2、HeLa和A549細(xì)胞缺氧24h后，miR-483及miR-675在各細(xì)胞系中的表達(dá)與其宿主基因 Igf2及H19的表達(dá)皆不一致。HepG2和HeLa細(xì)胞中H19表達(dá)無明顯變化，A549細(xì)胞中H19的表達(dá)有所下調(diào)，而各細(xì)胞中miR-675的表達(dá)明顯上調(diào)；各細(xì)胞中IGF2表達(dá)皆下調(diào)，而miR-483的表達(dá)明顯上調(diào)。缺氧上調(diào)miR-483與miR-675的表達(dá)很可能是通過介導(dǎo)其生成，促進(jìn)其表達(dá)水平上調(diào)。miR-483與m

7、iR-675具有其各自獨(dú)特的加工機(jī)制。
　　4.Igf2是miR-483的宿主基因，miR-483卻能反饋下調(diào)Igf2基因的mRNA表達(dá)水平； miR-675能夠抑制其宿主基因H19對IGF2的下調(diào)，而上調(diào)IGF2的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-483后IGF2的表達(dá)水平下調(diào)，而對H19的表達(dá)沒有影響。同時，過表達(dá)miR-675后，H19表達(dá)無明顯變化，而IGF2則表達(dá)上調(diào)。初步認(rèn)為，miR-675可能負(fù)反饋調(diào)節(jié)其宿主基因H19的

8、功能，促進(jìn)IGF2的表達(dá)。
　　5.篩選得到了miR-483的一個靶基因-PDGFB。過表達(dá)miR-483后PDGFB的mRNA水平下調(diào)初步認(rèn)為PDGFB是miR-483的候選靶基因；雙熒光素酶報告基因證實(shí)，miR-483能夠直接作用于PDGFB的3’UTR區(qū)；過表達(dá)miR-483后可以顯著抑制HepG2細(xì)胞中內(nèi)源PDGFB蛋白的表達(dá)； Chromeceptin處理HepG2細(xì)胞6h及12h后，PDGFB的表達(dá)明顯上調(diào)；而CoCl