miR-196b和miR-30a在慢粒發(fā)病機(jī)制中的功能與表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(ChronicMyelogenousLeukemia，CML)，簡稱慢粒，是一種發(fā)生在造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病，是我國慢性白血病中最常見的一種類型。95％的慢粒具有Ph染色體，即特異性的t(9;22)(q34;q11)核型，并存在BCR-ABL1融合基因的表達(dá)。Ph染色體是9號和22號染色體長臂易位的結(jié)果，易位使9號染色體長臂(9q34)上的原癌基因ABL和22號染色體(22q11)上的BCR基因重新組合成BCR

2、-ABL1融合基因。不同的BCR-ABL1融合基因類型與疾病表型相關(guān)。BCR-ABL1融合基因中，主要由ABL段攜帶細(xì)胞惡變的主要信息，ABL1屬Abelson（白血病病毒）家族的非受體酪氨酸激酶，目前主要用于在惡性腫瘤中的研究，而BCR段的斷裂位點(diǎn)主要影響疾病表型。在慢粒中，BCR-ABL1融合基因轉(zhuǎn)錄為8.5kb的mRNA，并進(jìn)一步翻譯產(chǎn)生分子質(zhì)量為210KD的BCR-ABL1融合蛋白P210BCR/ABL，該蛋白具有異常酪氨酸激酶

3、活性，其中ABL的SH1結(jié)構(gòu)域TK活性異常，導(dǎo)致與ATP結(jié)合，使與ABL結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白發(fā)生磷酸化而激活，并作用于一系列下游的信號傳導(dǎo)通路，包括RAS-MAPK通路、JAK-STAT通路、PI-3K激酶通路、MYC通路等，不但干擾調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的增殖和抑制凋亡，而且引起造血干細(xì)胞調(diào)節(jié)生長和分化的必須黏附程序的缺失，最終導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞大量增生、凋亡減少與骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附性下降，使大量不成熟的髓細(xì)胞釋放到外周血，導(dǎo)致慢粒的發(fā)生。因此，BCR

4、-ABL1融合基因被認(rèn)為是慢粒發(fā)病的分子病理基礎(chǔ)，也是慢粒診斷、療效觀察、預(yù)后等監(jiān)測的有效指標(biāo)。近年來以BCR-ABL1為靶點(diǎn)的研究主要集中在酪氨酸激酶抑制劑和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，和miRNA相關(guān)的研究很少。
　　 miRNA是一類長21～25nt的小分子非編碼單鏈RNA的總稱，由大約70nt大小的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)

5、調(diào)控。miRNA在表達(dá)上具有組織和時間的特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達(dá)的重要調(diào)控分子，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。miRNA表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，大約50％得到注解的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)（fragilesite），這說明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。研究表明，microRNAs與腫瘤形成相關(guān)，既能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，也能起到癌基因的作用。一個起腫瘤抑制基因作用

6、的miRNA表達(dá)下降或者缺失可能是由于miRNA生物合成的任何步驟發(fā)生缺陷造成的，而這最終將導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)膍iRNA靶基因表達(dá)，最后可能導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、侵入、凋亡減少、不能正常分化或者去分化，引起腫瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA過表達(dá)也將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，在這種情形下，由于miRNA基因的擴(kuò)增，持續(xù)性的啟動子活性，miRNA加工的效率增高，或是miRNA的穩(wěn)定性提高等，導(dǎo)致在異常組織或是不適當(dāng)發(fā)育階段這些miRNA的表達(dá)增加，導(dǎo)致其靶

7、基因（抑癌基因）表達(dá)下降，引起腫瘤發(fā)生。
　　 本研究首先采用多個生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA，相關(guān)預(yù)測軟件包括TargetScan、PicTa、miRBase、miRanda、Mirnaviewer、DIANATarBase，預(yù)測結(jié)果表明靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA包括miR-196b和miR-30a;其次對miR-196b和miR-30a用生物信息學(xué)軟件預(yù)測和慢粒關(guān)系密切的靶基因

8、，綜合各個軟件的預(yù)測結(jié)果，表明miR-196b可能的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a可能的靶基因包括BCR-ABL1，因此本課題擬以miR-196b和miR-30a為研究對象，研究其在慢粒中的功能和表達(dá)調(diào)控。
　　 首先，以K562細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增BCR-ABL1mRNA3'UTR序列和HOXA9mRNA3'UTR序列，與psiCHECKTM-2vector連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒psiCHECKTM-2

9、-BCR-ABL1-3'UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR。其次，以重組質(zhì)粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR為模板，進(jìn)行亞克隆。采用SOE的方法，擴(kuò)增BCR-ABL1-3'UTR中miR-196b、miR-30a結(jié)合位點(diǎn)種子序列分別突變的序列，擴(kuò)增HOXA9-3'UTR中miR-196b結(jié)合位點(diǎn)的2個種子序列突變的序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒psiCHE

10、CKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR-Mutant-196b、psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR-Mutant-30a、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR-Mutant。其次，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶基因的確認(rèn)。設(shè)立mimics組、NC組、mutant組和mock組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在293T細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h后檢測各組熒光值，結(jié)果用SPSS13.0的OneWayANOVA進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分

11、析結(jié)果表明196bmimics+ABL1和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即196bmimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1;196bmimics+HOXA9和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即196bmimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-196b的靶基因包括HOXA9;30amimics

12、+ABL1和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即30amimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA和靶基因的對應(yīng)關(guān)系，我們對miR-196b和miR-30a進(jìn)行功能學(xué)研究。首先，以人基因組DNA為模板，擴(kuò)增miR-196b前體pre-miR-196b和miR-30a前體pre-miR-30a，與載體plVTHM連

13、接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體plVTHM-miR-196b和plVTHM-miR-30a。慢病毒表達(dá)載體分別和質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包病毒，用病毒液感染K562細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)miR-196b細(xì)胞和過表達(dá)miR-30a細(xì)胞，并研究miRNA過表達(dá)細(xì)胞的增殖、周期、miRNA的表達(dá)，以及BCR-ABL1和HOXA9的表達(dá)。其次，對miRNA過表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor，降低細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，檢測細(xì)

14、胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表達(dá)，判斷回復(fù)情況。最后，對靶基因BCR-ABL1和HOXA9轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，檢測細(xì)胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表達(dá)，判斷細(xì)胞功能是否和過表達(dá)miRNA細(xì)胞功能一致。結(jié)果表明在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-196b后，細(xì)胞增殖明顯抑制，G2期阻滯，miR-196b表達(dá)升高，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白表達(dá)下降。在過表達(dá)miR-196b細(xì)胞中抑制miR-196b的

15、表達(dá)后，細(xì)胞增殖增強(qiáng)(P＜0.05)，周期恢復(fù)，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均升高。在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-30a后，細(xì)胞增殖明顯抑制，G1期阻滯，miR-30a表達(dá)升高，BCR-ABL1蛋白表達(dá)下降。在過表達(dá)miR-30a細(xì)胞中抑制miR-30a的表達(dá)后，細(xì)胞增殖增強(qiáng)(P＜0.05)，周期恢復(fù)，BCR-ABL1蛋白水平明顯升高。在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ABL1siRNA后，BCR-ABL1mRNA水平下降，BCR-ABL

16、1蛋白水平下降，細(xì)胞增殖抑制(P＜0.05)，G1期阻滯，和miR-30a過表達(dá)細(xì)胞增殖情況基本一致。在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HOXA9siRNA后，HOXA9mRNA水平下降，HOXA9蛋白表達(dá)水平下降，細(xì)胞增殖抑制(P＜0.05)，G1期阻滯，增殖比過表達(dá)miR-196b細(xì)胞快一些。細(xì)胞過表達(dá)研究和抑制表達(dá)研究的結(jié)果進(jìn)一步證明:miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a的靶基因包括HOXA9，且在慢粒中mi

17、R-196b和miR-30a都起到腫瘤抑制作用。
　　 miRNA的表達(dá)常常和表觀遺傳有關(guān)，表觀遺傳指DNA序列并不發(fā)生變化而基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，其主要機(jī)制是由細(xì)胞內(nèi)除遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)所誘發(fā)且在細(xì)胞發(fā)育和增殖過程中能夠穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳現(xiàn)象種類很多，但DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳現(xiàn)象最常見，且與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活和N端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄后修飾，使DNA甲基化和組

18、蛋白修飾成為目前表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)在腫瘤研究領(lǐng)域內(nèi)重要分支。DNA甲基化主要包括整個基因組去甲基化和部分區(qū)域高度甲基化，其中DNA去甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尤為明顯，另外組蛋白修飾也是基因表達(dá)調(diào)控以及誘發(fā)腫瘤形成的重要表觀遺傳機(jī)制之一。許多研究揭示，miRNA受甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳機(jī)制調(diào)控，表觀遺傳對miRNA分子產(chǎn)生重要的調(diào)控且直接參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程。因此本課題下一步將研究miR-196b和miR-30a在慢粒中

19、的表達(dá)是否和表觀遺傳調(diào)控有關(guān)。
　　 首先，采用去甲基化藥物5-Aza-2’-dc處理K562細(xì)胞，檢測K562處理前后細(xì)胞的周期、凋亡、miR-196b和miR-30a的表達(dá)、BCR-ABL1和HOXA9的表達(dá)變化。其次，對miR-196b和miR-30a啟動子CpG島進(jìn)行預(yù)測，并采用BSP法檢測K562細(xì)胞在5-Aza-2’-dc處理前后miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，根據(jù)BSP結(jié)果選出一段甲基化程度比較高、處理前

20、后變化比較大的序列在臨床樣本中進(jìn)行檢測。最后，提取16例慢?；颊吆?0例正常人總RNA，檢測miR-196b和miR-30a的表達(dá)水平，提取45例白血病患者和10例正常人基因組，采用MSP法檢測miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，采用SPSS13.0的多樣本率比較x2檢驗(yàn)對MSP的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。K562細(xì)胞中的研究結(jié)果表明，K562用5-Aza-2’-dc處理后，G2期發(fā)生阻滯，增殖抑制，出現(xiàn)凋亡。K562細(xì)胞中miR-19

21、6b啟動子CpH島高甲基化，用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理后，甲基化水平下降，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均下降，但miR-196b的表達(dá)并未恢復(fù)，提示降低miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，可使miR-196b的靶基因BCR-ABL1和HOXA9表達(dá)下降，但該作用是否通過改變miR-196b的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，需進(jìn)一步研究。臨床樣本研究表明，慢?；颊咧衜iR-196b的表達(dá)低于正常人，統(tǒng)計(jì)各類型白血病和正常人中甲基化陽性和甲基化

22、陰性的比例，結(jié)果采用多樣本率比較x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明各類型樣本間差異有顯著性意義(P＜0.05)，其中CML中miR-196b啟動子CpG島甲基化和正常人相比有顯著性差異(P＜0.05)，且CML中miR-196b啟動子CpG島甲基化陽性率高于正常人。結(jié)合細(xì)胞和臨床樣本研究結(jié)果，我們得到結(jié)論:慢粒中miR-196b低表達(dá)，降低miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，可導(dǎo)致其靶基因BCR-ABL1和HOXA9表達(dá)下降，提示miR-

23、196b啟動子CpG島高甲基化可能和慢粒發(fā)病有關(guān)。關(guān)于miR-30a臨床樣本的研究表明，慢?；颊咧衜iR-30a的表達(dá)低于正常人，細(xì)胞功能學(xué)研究表明miR-30a在慢粒中是抑癌基因，因此推測miR-30a的低表達(dá)和慢粒的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，但是miR-30a啟動子沒有預(yù)測到有CpG島，因此推測miR-30a的表達(dá)降低和miR-30a啟動子CpG島甲基化水平無關(guān)，另有其它機(jī)制，如miR-30a啟動子發(fā)生突變，miR-30a存在雜合性缺失等，具體

24、機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 綜上所述，本課題在生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)初步確認(rèn)了miR-196b和miR-30a的靶基因，接著在K562細(xì)胞中進(jìn)行了過表達(dá)和抑制表達(dá)研究，闡明了慢粒中miR-196b和miR-30a的功能，證明了miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1，且在慢粒中miR-196b和miR-30a都起到腫瘤抑制作用。最后采用B

25、SP法檢測了K562細(xì)胞在用去甲基化藥物處理前后miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，并采用MSP法檢測了45例白血病患者和10例正常人中miR-196b啟動子CpG島甲基化情況，并檢測了miR-196b和miR-30a在慢粒和正常人中的表達(dá)，結(jié)果提示慢粒中miR-196b啟動子CpG島的高甲基化可能和miR-196b的低表達(dá)有關(guān)，miR-196b的低表達(dá)是引起慢粒發(fā)病的機(jī)制之一，也為慢粒的治療提供了一個潛在靶點(diǎn)。結(jié)果也表明miR-