人參三七川芎提取物對衰老血管骨架蛋白和自噬的干預作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 自然衰老大鼠胸主動脈細胞骨架的改變及益氣活血中藥的干預作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對自然衰老大鼠胸主動脈及骨架蛋白的影響。
　　方法:以自然衰老大鼠胸主動脈作為研究對象，21月齡大鼠作為衰老模型，實驗分為模型組、中藥低、中、高劑量組及白藜蘆醇組，各給藥組分別從18月齡開始藥物干預，連續(xù)灌胃3個月，給藥濃度分別為中藥低(0.58g/kg)、中(1.16g/kg)、高

2、(2.32g/kg)劑量組及白藜蘆醇組(50mg/kg)，模型組給予同體積的純凈水，同時以3月齡SD大鼠作為青年組。應用HE染色觀察血管形態(tài)的改變，β-半乳糖苷酶特異染色法計算藍染組織比率，免疫熒光染色觀察骨架蛋白F-actin形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:與青年組相比，模型組血管內(nèi)膜損傷且不光滑，中膜明顯增生且排列紊亂，彈力板扭曲、斷裂、結(jié)構(gòu)不完整，外膜增生明顯，S

3、A-β-gal染色組織藍染比率明顯增加，F(xiàn)-actin熒光強度及蛋白表達明顯增多，而SM22α蛋白表達明顯減少;藥物干預后，血管壁內(nèi)皮受損不顯，中膜增厚不明顯，彈力膜結(jié)構(gòu)較完整，SA-β-gal染色組織藍染比率明顯降低，同時可以減少F-actin熒光強度及蛋白表達量并增加SM22α的蛋白表達。
　　結(jié)論:細胞骨架微絲蛋白F-actin形態(tài)及蛋白表達在衰老過程中改變明顯，其相關(guān)蛋白SM22α蛋白表達亦改變明顯，其可能共同參與了血管老

4、化的進程;人參三七川芎提取物可以一定程度上延緩血管老化，且對于血管F-actin和SM22α蛋白有明顯干預作用，其可能通過此作用延緩了血管老化的進程。
　　第二部分 復制性衰老血管平滑肌細胞骨架蛋白的改變及益氣活血中藥的干預作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對復制性衰老血管平滑肌細胞及其骨架蛋白F-actin和SM22α的影響。
　　方法:以人主動脈平滑肌細胞作為研究對象，復制性衰老9代細胞作為衰老模型，實驗分為青

5、年組（5代細胞）、模型組（9代細胞）、中藥低(100mg/L)、中(200mg/L)、高(400mg/L)劑量組及白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預時間為48小時。采用β-半乳糖苷酶特異染色法計算藍染細胞比率，CCK-8檢測細胞增殖能力，流式細胞技術(shù)分析細胞周期，免疫熒光染色觀察細胞F-actin、G-actin和SM22α形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α的蛋白表達情況。
　　結(jié)果:與青年組

6、相比，模型組細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，G0/G1期數(shù)量增多，S期數(shù)量減少，CCK-8檢測細胞增殖能力減弱，且β-半乳糖苷酶染色藍染數(shù)量增多，符合衰老模型特點，且F-actin部分呈縱向平行排列，形成大量應力纖維，蛋白表達升高;G-actin在細胞中央?yún)^(qū)域染色變?nèi)酰蛑苓厖^(qū)域不規(guī)則擴展，部分出現(xiàn)邊緣變模糊、空洞或呈敗絮狀;SM22α染色模糊暗淡，邊緣不顯，熒光強度明顯減弱，蛋白表達下降。藥物干預后，可以有效的降低β-半乳糖苷酶染色藍染細胞

7、數(shù)量，減少G0/G1期的細胞數(shù)量，同時增加S期的細胞數(shù)量，減少F-actin蛋白的表達量及應力纖維的形成，增強SM22α熒光染色強度及蛋白表達量，并具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:復制性衰老的血管平滑肌細胞可以作為衰老研究的模型;骨架蛋白F-actin和SM22α的形態(tài)和蛋白表達在細胞衰老過程中改變明顯，其可能一同參與了平滑肌細胞衰老的進程;人參三七川芎提取物一定程度上延緩了血管平滑肌細胞的老化，且對于F-actin和SM22α有明顯

8、干預作用，并可能通過此作用延緩了血管老化的進程。
　　第三部分 益氣活血中藥對復制性衰老平滑肌細胞骨架蛋白作用機制探討
　　目的:探討人參三七川芎提取物對復制性衰老血管平滑肌細胞骨架蛋白的作用機制。
　　方法:以人主動脈平滑肌細胞作為研究對象，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立HSP27基因敲低的衰老模型，實驗分為基因未敲低衰老組、基因未敲低中藥組(200mg/L)、基因未敲低白藜蘆醇組(10umol/L)、基因敲低衰老組、基因敲

9、低中藥組(200mg/L)及基因敲低白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預時間為48小時。采用β-半乳糖苷酶特異染色法計算藍染細胞比率，免疫熒光染色觀察細胞F-actin和SM22α形態(tài)的改變，Western blot檢測F-actin和SM22α的蛋白表達情況。
　　結(jié)果:與HSP27基因未敲低衰老組相比，HSP27基因敲低衰老組SA-β-gal染色藍染細胞數(shù)量增多，F(xiàn)-actin和SM22α熒光強度及蛋白表達明顯減少，差異均

10、具有統(tǒng)計學意義;而基因敲低各組之差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:將平滑肌細胞HSP27基因敲低后，SA-β-gal染色藍染細胞數(shù)量增多，表明細胞老化程度加深;平滑肌細胞HSP27基因敲低后，磷酸化的HSP27隨之下降，骨架蛋白F-actin及相關(guān)蛋白SM22α表達量下降，明確了HSP27基因?qū)毎羌艿恼{(diào)節(jié)作用，并可能通過此作用參與了調(diào)節(jié)血管老化的過程;HSP27基因敲低各組藥物干預作用不如未敲低各組明顯，考慮人參三七川芎提取物作用

11、靶點有可能與HSP27/磷酸化HSP27/F-actin通路有關(guān)。
　　第四部分 益氣活血中藥對誘導自噬的血管平滑肌細胞的干預作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物對復制性衰老及饑餓誘導自噬發(fā)生的血管平滑肌細胞的干預作用。
　　方法:本研究以復制性衰老的平滑肌細胞為研究對象，實驗分為四組，分別為青年組、衰老模型組、中藥組(200mg/L)、白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預時間為48小時，利用Western bl

12、ot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3-Ⅱ的表達;并利用饑餓誘導自噬的發(fā)生，建立了饑餓2小時而發(fā)生自噬的血管平滑肌細胞模型，實驗分為四組，分別為正常組、饑餓2h模型組、中藥組(200mg/L)、白藜蘆醇組(10umol/L)，藥物干預時間為48小時，利用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形成，用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3-Ⅱ的表達。
　　結(jié)果:與青年組相比，哀老模型組的Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白

13、表達明顯減少，具有顯著差異性(P＜0.01);與衰老模型組相比，中藥及白藜蘆醇組Beclin1及LC3-Ⅱ蛋白表達增多，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與正常組相比，饑餓模型組的細胞不規(guī)則變形，細胞膜損傷，染色質(zhì)呈顆粒狀，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及自噬空泡，次級溶酶體增多，Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白表達明顯增多，具有顯著差異性(P＜0.01);與饑餓模型組相比，中藥及白藜蘆醇組細胞形態(tài)規(guī)則，核膜相對光滑完整，胞質(zhì)中產(chǎn)生大量的