原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型的建立及損傷后calpain1表達(dá)變化規(guī)律的研究.pdf

1、目的：
　　 腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中常見的損傷類型，腦損傷發(fā)生后的繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的分子機制一直為各國學(xué)者所關(guān)注。以往關(guān)于腦損傷研究的模型存在腦損傷的力學(xué)特點不規(guī)則，同樣的力造成不同動物腦損傷程度不一致及損傷影響范圍不易控制等問題。而原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞樣本較均勻，可以較好地控制損傷方法和損傷程度，損傷后觀察和檢測也比較方便，尤其在進行某些損傷機制方面的研究有其明顯的優(yōu)越性，因此制作合適的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型對研究顱腦損傷的機制具

2、有重要意義。
　　 本實驗成功建立了原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，應(yīng)用倒置顯微鏡及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)觀察神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷后的形態(tài)學(xué)變化，同時應(yīng)用western blot方法檢測神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷后calpainl及其底物map2在蛋白水平上表達(dá)隨時間變化的情況，研究calpainl在腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用，并對calpainl及map2表達(dá)變化的時間規(guī)律在推斷腦損傷形成時間方面的應(yīng)用進行了探討。<

3、br>　　 實驗材料與方法：
　　 選擇出生后1～2天的Wistar仔鼠，取大腦皮質(zhì)組織，剪碎，體積分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化，終止反應(yīng)，離心，沉淀細(xì)胞用含15％馬血清及1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮，過濾使之成為單細(xì)胞懸液，按2×106個/ml種植于預(yù)先包被多聚賴氨酸的六孔培養(yǎng)板中（免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色需預(yù)先在六孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天后加終濃度101μmol/L 阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長

4、。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時，隨機分為1個對照組及4個損傷組，損傷組神經(jīng)細(xì)胞用含0.5mmol/L連二亞硫酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基進行缺氧缺糖損傷30min，損傷后換原培養(yǎng)基分別繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、12h、24h。對照組只常規(guī)換液一次。對照組及損傷組神經(jīng)細(xì)胞分別進行活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和western blot檢測。
　　 結(jié) 果：
　　 本實驗應(yīng)用連二亞硫酸鈉加低糖培養(yǎng)基成功制作了原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)

5、細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，通過活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷后24h內(nèi)形態(tài)學(xué)發(fā)生了一系列改變。對照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好，胞體豐滿，呈橢圓形或多極形，樹突、軸突較長并相互交織。OGD損傷1h后，大部分神經(jīng)細(xì)胞仍保持原有形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞突起縮短。傷后6h、12h，神經(jīng)細(xì)胞胞體明顯皺縮，多數(shù)細(xì)胞突起縮短，甚至消失。傷后24h，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)，胞體變圓，部分突起重新出現(xiàn)。
　　 Western blot

6、結(jié)果顯示calpainl及其底物map2在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中有表達(dá)。神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷后1h、6h、12h、24h，calpainl和map2蛋白表達(dá)強度改變有一定規(guī)律。與對照組相比，calpainl蛋白水平在OGD損傷后1h、6h、12h、24h表達(dá)均增強，其中傷后6h、12h組calpainl表達(dá)處于較高水平，傷后24h組calpainl表達(dá)高于1h組。與對照組相比，map2蛋白水平在OGD損傷后1h、6h、12h、24h表達(dá)均降