乙醇對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞影響的掃描電鏡及CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 乙醇對(duì)大腦有神經(jīng)毒性作用,進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)后可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性作用。乙醇能引起神經(jīng)行為的改變,隨著血中乙醇濃度的升高,人的注意力、判斷力及辨別力均會(huì)不同程度受損,而可能引發(fā)各種刑事案件和民事案件,因此很有必要對(duì)乙醇與機(jī)體的作用進(jìn)行深入的研究。本研究用不同濃度乙醇作用原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞后,采用倒置顯微鏡、HE染色及掃描電鏡觀察皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變；采用免疫組化SP法,研究皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS

2、和NSE表達(dá)的時(shí)序性變化,探討它們之間的相互關(guān)系以及參與腦損傷的機(jī)理。
　　 方法:
　　 1、采用清潔級(jí)新生SD大鼠(出生后24 h內(nèi)),分離大腦皮質(zhì),進(jìn)行體外培養(yǎng),采用免疫組化SP法進(jìn)行皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的純度鑒定,選擇皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞純度高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組及低、中和高劑量組。低、中和高劑量組在培養(yǎng)液中加入無(wú)水乙醇,使培養(yǎng)液中乙醇濃度分別為0.5 g／L、1.5 g／L和3.0 g／L；對(duì)照組在培養(yǎng)液中加入等

3、量生理鹽水。分別處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞30min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。
　　 2、通過(guò)HE染色法觀察不同濃度乙醇作用下、不同時(shí)間點(diǎn)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 3、通過(guò)掃描電鏡觀察不同濃度乙醇作用下、不同時(shí)間點(diǎn)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 4、采用免疫組化SP法研究不同濃度乙醇作用下、不同時(shí)間點(diǎn)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞CYP2E1、iNOS和NSE表達(dá)的變化。

4、
　　 5、統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,采用LSD法進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng):皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)第9 d分化成熟,倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體飽滿(mǎn),折光性強(qiáng),胞核位于細(xì)胞中央或偏于一側(cè),胞核及核仁清晰可見(jiàn),細(xì)胞突起長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng),突起粗大并交織成網(wǎng)狀。
　　 2、大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的純度鑒

5、定:NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,陰性對(duì)照可見(jiàn)細(xì)胞漿及突起呈淡藍(lán)色,陽(yáng)性反應(yīng)可見(jiàn)細(xì)胞漿及突起呈棕黃色。計(jì)算出每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的平均比值為90％,即神經(jīng)細(xì)胞純度為90％。
　　 3、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞倒置顯微鏡下的表現(xiàn):0.5 g／L乙醇作用后,各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)改變與對(duì)照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞呈梭形或長(zhǎng)梭形,胞漿內(nèi)可見(jiàn)圓形空泡。3.0 g／L乙醇作用后,隨著乙醇濃度和作用時(shí)

6、間增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞腫大變圓,細(xì)胞漿內(nèi)圓形空泡增多,細(xì)胞突起變短明顯,細(xì)胞核腫大或消失,細(xì)胞間連接消失。
　　 4、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞HE染色結(jié)果:0.5 g／L乙醇作用后,各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的形態(tài)改變與對(duì)照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,可見(jiàn)細(xì)胞胞體腫大、變圓,細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡,胞核不規(guī)則淡染。3.0 g／L乙醇作用后,隨著乙醇濃度和作用時(shí)間的增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞腫大變圓,

7、細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡；部分細(xì)胞胞體變小、深染、或呈三角形,細(xì)胞漿紅染加深,細(xì)胞核小而深染,核仁不明顯,細(xì)胞間連接消失。
　　 5、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞掃描電鏡觀察結(jié)果:0.5g／L乙醇作用后,各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)改變與對(duì)照組基本相同。1.5 g／L乙醇作用8 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,部分細(xì)胞胞體呈梭形、長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形,突起變短明顯；少數(shù)細(xì)胞胞體表面的樹(shù)突棘形態(tài)發(fā)生改變,胞體局部失去與其他細(xì)胞的連接。3.0 g／L乙醇作用后,隨著

8、乙醇濃度和作用時(shí)間的增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞胞體腫大變圓,部分細(xì)胞呈不規(guī)則形,突起變短；隨著作用時(shí)間增加,表面呈凹陷狀、不規(guī)則形的細(xì)胞逐漸增多,突起變短明顯,部分細(xì)胞樹(shù)突棘的形態(tài)發(fā)生改變；最后大部分細(xì)胞塌陷呈平鋪狀,細(xì)胞突起消失,細(xì)胞之間的連接消失。
　　 6、乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1、iNOS和NSE的表達(dá)結(jié)果:(1)CYP2E1的表達(dá)結(jié)果:對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1只有輕度表達(dá)；0.5 g／L乙醇作

9、用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1的表達(dá)稍有增強(qiáng)；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1表達(dá)逐漸增強(qiáng),2 h時(shí)CYP2E1表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),12 h時(shí)CYP2E1表達(dá)最強(qiáng),24h時(shí)CYP2E1表達(dá)仍高于正常；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CYP2E1表達(dá)逐漸增強(qiáng),1 h時(shí)CYP2E1表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),8 h時(shí)CYP2E1表達(dá)最強(qiáng),隨后表達(dá)逐漸下降,24 h時(shí)CYP2E1表達(dá)仍高于正常。(2)iNOS的表達(dá)結(jié)果:對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)

10、細(xì)胞內(nèi)iNOS只有極輕度表達(dá)；0.5 g／L乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)稍有增強(qiáng)；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)逐漸增強(qiáng),2 h時(shí)iNOS表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),12 h時(shí)iNOS表達(dá)最強(qiáng),隨后表達(dá)逐漸下降,24 h時(shí)iNOS表達(dá)仍高于正常；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)逐漸增強(qiáng),1 h時(shí)iNOS表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),8 h時(shí)iNOS表達(dá)最強(qiáng),隨后表達(dá)逐漸下降,24 h時(shí)iNOS表達(dá)仍高于正常。(3)

11、NSE的表達(dá)結(jié)果:對(duì)照組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NSE呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；0.5 g／L乙醇作用后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NSE的表達(dá)稍減弱；1.5 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NSE表達(dá)逐漸下降,2 h時(shí)NSE表達(dá)開(kāi)始下降,12 h時(shí)NSE表達(dá)最弱；3.0 g／L乙醇作用后,皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NSE表達(dá)下降比較快,1 h時(shí)NSE表達(dá)開(kāi)始下降,8 h時(shí)NSE表達(dá)最弱。
　　 結(jié)論:
　　 1、不同濃度乙醇作用原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞后,倒置顯微鏡