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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),體外檢測(cè) miR210基因誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨和成血管方向分化的作用,探索目的基因雙重調(diào)控作用,為將來(lái)修復(fù)骨缺損打下基礎(chǔ)。
方法:體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) BMSCs表面標(biāo)志物;構(gòu)建慢病毒載體 Lenti-miR-210和 Lenti-LacZ,并分別用Lenti-LacZ和 Lenti-miR-210轉(zhuǎn)染 BMSCs,并在轉(zhuǎn)染后的3~5d在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)
2、染效率;應(yīng)用MTT法檢測(cè)病毒對(duì) BMSCs增殖率的影響,并在目的基因轉(zhuǎn)染 BMSCs的第0天、第1天、第4天、第7天、第14天和第21天分別提取 mRNA和蛋白,利用RT-PCR和 Western blot檢測(cè)關(guān)鍵性成血管和成骨因子的表達(dá)。同時(shí)目的基因轉(zhuǎn)染第21天,通過(guò)堿性磷酸酶( ALP)和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察體外骨形成的情況。檢測(cè)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
結(jié)
3、果:倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為梭形,旋渦狀生長(zhǎng),流式細(xì)胞儀分析顯示,BMSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原 CD44、CD90高度表達(dá),造血干細(xì)胞表面抗原 CD34和CD45表達(dá)陰性,推斷出所培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)=10時(shí),BMSCs的轉(zhuǎn)染效率最高,且病毒對(duì) BMSCs增殖能力無(wú)顯著影響,在病毒轉(zhuǎn)染后的5d,倒置熒光顯微鏡觀察,病毒轉(zhuǎn)染效率均在90%以上, MOI=10時(shí),病毒對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響(P>0.05
4、);RT-PCR結(jié)果顯示,目的基因轉(zhuǎn)染的第4天、第7天、第14天和第21天,miR-210能夠顯著上調(diào) BMSCs關(guān)鍵性成骨和成血管因子的表達(dá)(P<0.05);Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,蛋白表達(dá)與 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)幾乎一致。ALP和茜素紅鈣結(jié)節(jié)表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示,相較 BMSCs組及Lenti-LacZ/BMSCs組,Lenti-miR-210/BMSCs組 ALP和鈣結(jié)節(jié)表達(dá)顯著提高。
結(jié)論:以慢病毒為載體的
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