骨折后不同代次大鼠BMSCs體外共培養(yǎng)及其成骨誘導的實驗研究.pdf

1、目的：探討骨折后不同代次大鼠 BMSCs在體外共培養(yǎng)條件下的增殖及成骨能力的實驗研究。
　　方法：①3月齡雄性大鼠15只,制作骨折及骨折后內固定模型，分別于術后1 d、1w、2w行大X線檢查骨折愈合及克氏針在位情況。②取喂養(yǎng)2w大鼠骨折端BMSCs，進行原代、傳1代、傳2代、傳3代體外增殖培養(yǎng)，將原代及傳代培養(yǎng)的BMSCs分別編號為 P0、P1、P2、P3，將單代次BMSCs設為對照組，編為第I組。③將不同2代次培養(yǎng)設為第II組，

2、同理，將3種不同代次BMSCs共培養(yǎng)設為第III組,將4種不同代次BMSCs設為第IV組，進行體外共培養(yǎng)。④各組BMSCs細胞培養(yǎng)8天，每天行MTT檢測并其繪制其生長曲線。⑤各組BMSCs成骨誘導分化3周后，進行堿性磷酸酶染色同時行堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色并鈣結節(jié)計數及Western Blot檢測BMP-2蛋白含量。⑥分別進行組間統(tǒng)計學分析。
　　結果：①骨折模型制作成功，在術后1d、1w、2w的X線檢測中，克氏針均在位，骨

3、折無明顯愈合跡象。②倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：各組 BMSCs生長均呈放射狀集落貼壁生長，共培養(yǎng)組細胞在鏡下觀察有各代細胞，形態(tài)不一。③ MTT法檢測生長情況：各組在開始24小時各組均出現(xiàn)生長滯緩期，差異較小，24小時后，IV組細胞開始大量增殖，進入對數生長期，生長速率較快，持續(xù)約3天，最早到達峰值，保持較高水平約48小時，然后緩慢下降；隨著組合細胞代次的減少，增殖數量由高到低，平臺期持續(xù)時間逐漸縮短，衰竭期下降速率由慢到快。④各組

4、BMSCs細胞向成骨細胞誘導培養(yǎng)，排列呈魚群樣，生長旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大。⑤堿性磷酸酶化學染色：所有組別BMSCs成骨誘導后均能被染色，成骨細胞胞漿內可見棕褐色陽性顆粒。⑥堿性磷酸酶活性檢測：I、II、III、IV多組作單因素方差分析，2d、4d、6d無明顯差異，第8d見 III組為27.25±0.45、IV組為29.56±0.52與 I組25.19±0.80相比有統(tǒng)計學差異。⑦各組BMSCs成骨誘導后茜素紅染色檢測均呈陽性反應

5、，出現(xiàn)橘紅色鈣結節(jié)，提示成骨誘導成功。⑧鈣結節(jié)計數提示：共培養(yǎng)組BMSCs的鈣結節(jié)大而多I-IV組鈣結節(jié)計數分別為：31.50±1.50、33.43±1.14、34.85±1.48、34.12±2.76，II、III、IV組與I組比較有統(tǒng)計學差異，而共培養(yǎng)組內比較無統(tǒng)計學差異。⑨ Western Bolt檢測發(fā)現(xiàn)I-IV組BMP-2蛋白含量依次增加，分別為0.694±0.080、0.741±0.469、0.832±0.035、0.935