微納形貌鉭及鉭-羥基磷灰石涂層對骨髓間充質干細胞生物學活性的影響.pdf

1、隨著種植牙技術的發(fā)展和普及，越來越多的人將種植牙作為缺牙修復的首要選擇。種植體與周圍骨之間快速、穩(wěn)定的骨結合是種植牙成功的關鍵，也是種植體表面改性的主要目標。
　　種植體的表面形貌和化學成分是影響骨整合能力的重要因素。涂層修飾能夠有效地改善種植體表面理化性質，形成有利于骨整合的材料/細胞界面，從而提高種植體的骨整合性能。羥基磷灰石(HA)是常見的種植體表面涂層材料，然而良好的生物活性并不能彌補其脆性大及界面結合強度低等弱點。在羥基

2、磷灰石中摻入添加劑制備復合涂層是提高其力學性能的重要發(fā)展方向。多孔鉭憑借其優(yōu)異的生物學性能，被視作新一代的金屬植入材料，已在關節(jié)外科領域取得了顯著的臨床療效。近年來，鉭作為表面涂層材料，引起了人們的廣泛興趣。目前，通過對生物材料的微觀結構和性能設計來調控干細胞的生物學行為是國內外研究的熱點。從仿生學角度，微納結構能更好地模擬細胞生存的微環(huán)境，有利于骨組織的修復再生。
　　本研究中我們采用大氣等離子噴涂技術，在純鈦表面制備微納形貌的

3、鉭以及鉭/羥基磷灰石復合涂層并檢測其表面理化特性。以大鼠骨髓間充質干細胞為模型，體外研究鉭以及鉭/羥基磷灰石復合涂層對骨髓間充質干細胞的粘附、增殖以及成骨分化等生物學行為的影響，為進一步動物體內研究涂層種植體骨結合性能奠定基礎，為種植體表面改性的優(yōu)化設計提供新思路以及新型種植體的探索提供理論依據(jù)。
　　第一部分微納形貌鉭涂層對骨髓間充質干細胞生物學活性的影響
　　目的:研究鈦表面微納形貌鉭涂層的表面理化特性以及蛋白吸附性能，

4、探討微納形貌鉭涂層對骨髓間充質干細胞粘附、增殖和成骨分化等生物學行為的影響，以評價其細胞相容性，并為種植體表面改性的優(yōu)化設計提供參考依據(jù)。
　　方法:
　　1、在本課題組前期的研究基礎上，利用大氣等離子噴涂技術在純鈦表面制備微納形貌的鉭涂層。經過參數(shù)優(yōu)化，電弧功率設定為25KW，噴射距離為130mm。
　　2、利用掃描電子顯微鏡觀察試樣的表面形貌，衍射儀分析其物相組成，輪廓儀檢測試樣的粗糙度并測定表面接觸角;采用垂直拉

5、伸法測定涂層試件的結合強度;
　　3、采用MicroBCA法對試件表面吸附蛋白進行定量檢測。
　　4、通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離原代大鼠骨髓間充質干細胞、培養(yǎng)擴增并進行流式分子表型鑒定以及成脂、成骨分化鑒定。
　　5、將BMSCs與材料共培養(yǎng)，通過細胞核染色、計數(shù)材料表面粘附細胞，采用掃描顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)和細胞骨架，MTS法檢測細胞增殖活力。
　　6、對材料表面BMSCs進行成骨誘導，通過堿性磷

6、酸酶活、茜素紅染色以及細胞分泌Ⅰ型膠原、骨鈣素含量考察骨髓間充質干細胞的成骨分化能力。
　　7、采用Rea-time PCR方法檢測材料表面細胞成骨分化相關基因RuNX2、ALP、BMP-2和OPN的表達水平。
　　結果:
　　1、純鈦表面的鉭涂層形成淺碟狀微米坑和納米孔隙的微納多級復合結構。
　　2、對比純鈦和鈦涂層，微納結構鉭涂層的粗糙度較高，而表面接觸角較小，并與基體具有較高的界面結合強度。
　　3、

7、微納結構的鉭涂層吸附蛋白能力優(yōu)于純鈦和鈦涂層。
　　4、骨髓間充干細胞在鉭涂層表面粘附的數(shù)量明顯較多，伸展良好，而且細胞骨架排列有序。培養(yǎng)4天后，微納形貌涂層表面細胞的增殖活力開始高于純鈦。
　　5、相對于純鈦，微納結構涂層顯著促進了BMSCs的堿性磷酸酶的活性、Ⅰ型膠原和骨鈣素的分泌和細胞外基質的礦化，并且上調了成骨分化相關基因的表達，鉭涂層更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1、采用等離子噴涂技術在

8、純鈦表面形成的微納形貌鉭涂層致密均勻、結合力強且具有良好的親水性和蛋白吸附能力。
　　2、微納米形貌鉭涂層具有較好的細胞相容性，能夠促進BMSCs的粘附、增值和成骨分化能力。
　　第二部分微納形貌鉭/羥基磷灰石復合涂層對骨髓間充質干細胞生物學活性的影響
　　目的:采用大氣等離子噴涂技術，在純鈦表面制備微納形貌的鉭/羥基磷灰石復合涂層并研究其表面特性，考察微納形貌鉭/羥基磷灰石復合涂層對骨髓間充質干細胞生物學行為的影響，

9、以評價其生物相容性，為開發(fā)新型人工牙種植體提供依據(jù)，并篩選細胞相容性最佳的復合涂層。
　　方法:
　　1、采用大氣等離子噴涂技術，優(yōu)化參數(shù)，在純鈦表面制備微納形貌鉭/羥基磷灰石復合涂層。
　　2、通過掃描電子顯微鏡、X射線衍射儀、接觸角測試儀和粗糙度儀分別檢測涂層試樣的微觀形貌、物相組成、濕潤性和粗糙度，以表征其理化特性。
　　3、利用萬能力學試驗機測定涂層的結合強度，并用BCA法定量分析涂層試樣吸附蛋白能力。<

10、br>　　4、將骨髓間充質干細胞與不同質量比例的微納形貌鉭/羥基磷灰石復合涂層共培養(yǎng)，采用掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察材料表面的細胞形態(tài)并對細胞計數(shù)，MTS法檢測細胞活性。
　　5、對材料表面的BMSCs進行成骨誘導，采用全自動生化儀定量檢測細胞分泌鈣、堿性磷酸酶和骨鈣素的能力，采用茜素紅染色法半定量細胞外基質礦化水平，通過實時定量PCR方法檢測細胞成骨相關基因表達水平。
　　結果:
　　1、純鈦表面形成微納形貌鉭/羥基磷

11、灰石復合涂層，且均致密均勻，與基體結合良好。
　　2、隨著鉭質量比的增加，涂層的粗糙度呈增加趨勢，親水性逐漸降低，結合強度也逐漸增大，均介于鉭涂層和羥基磷灰石涂層之間，且具有良好的親水性和結合強度。
　　3、復合涂層蛋白吸附能力強于羥基磷灰石涂層和純鈦，不同質量比例的復合涂層組間并無統(tǒng)計學差異。
　　4、骨髓間充質干細胞在微納形貌鉭/羥基磷灰石復合涂層表面粘附的數(shù)量明顯較多，且充分伸展良好。培養(yǎng)3天后，微納形貌復合涂層

12、表面細胞的增殖活力開始高于純鈦。
　　5、相對于純鈦，微納形貌涂層顯著促進了BMSCs的堿性磷酸酶活性、Ca和骨鈣素分泌以及細胞外基質礦化，并且上調了成骨分化相關基因的表達水平，其中HA1Ta9和HA2Ta8涂層與羥基磷灰石涂層也具有統(tǒng)計學差異。
　　6、鉭/羥基磷灰石復合涂層促進BMSCs的成骨分化能力呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，即HA1Ta9＞HA2Ta8＞HA3 Ta7＞ HA4Ta6。
　　結論:
　　1、微納形貌