TGF-β1通過PP2Ac調(diào)控的Raf-MEK-ERK通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞谷氨酰胺分解.pdf

1、目的：探討在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞病理生理改變中谷氨酰胺分解變化及可能存在的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為研究對象，TGF-β1（10ng/ml）刺激內(nèi)皮細(xì)胞48h，western blot法檢測谷氨酰胺分解中的關(guān)鍵酶-腎型谷氨酰胺酶（KGA）的蛋白表達(dá)，用谷氨酸/谷氨酸氧化酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量的改變。同時(shí)western blot法檢測不同時(shí)間點(diǎn)下p-c-Ra

2、f(Ser259)、T-c-Raf、p-ERK1/2、T-ERK1/2和蛋白磷酸酶2Ac（PP2Ac）的表達(dá)，用絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性試劑盒來檢測蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性。用MEK1/2特異性活性抑制劑U0126（10μM）預(yù)處理細(xì)胞30min，western blot法檢測在TGF-β1刺激內(nèi)皮細(xì)胞15min或60min時(shí)KGA的表達(dá)。最后用PP2A特異性活性抑制劑OA或小分子干擾RNA（PP2Ac siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方

3、法特異性的抑制PP2A的活性，western blot法檢測在TGF-β1刺激內(nèi)皮細(xì)胞15min或60min時(shí)p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf、p-ERK1/2和T-ERK1/2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：在TGF-β1的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞中KGA蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量都明顯升高，短時(shí)間內(nèi)（90min）p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf和p-ERK1/2蛋白表達(dá)增多，而在總c-Raf蛋白中p-c-Raf(Se

4、r259)蛋白比例下降；PP2A在蛋白水平表達(dá)無明顯改變但磷酸酶的活性從15min開始增強(qiáng)，60min時(shí)達(dá)到峰值。在15min和60min時(shí)與模型組（TGF-β1）相比，抑制劑干預(yù)組（TGF-β1+U0126）的KGA蛋白表達(dá)下調(diào)（P﹤0.05）。用化學(xué)抑制劑OA或siRNA轉(zhuǎn)染的方法抑制PP2A的活性時(shí)，p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf和p-ERK1/2蛋白表達(dá)減少，在總c-Raf蛋白中p-c-Raf(Ser259)蛋白