玉米和蘆筍中腐馬素的污染分析及擬南芥對(duì)FB-,1-的抗性機(jī)理研究.pdf

1、腐馬素(fumonisins)是由串珠鐮刀菌和再譽(yù)鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生的一類真菌毒素。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)與動(dòng)植物中的神經(jīng)鞘氨醇類物質(zhì)類似，可以引起動(dòng)物各種疾病以及植物病害。一方面，腐馬素對(duì)某些牲畜有急性毒性及潛在的致癌性，如引起馬腦炎、豬肺水腫或大鼠肝癌，還能引起人類食道癌和神經(jīng)管缺陷，由于該毒素污染廣泛，在玉米、玉米制品以及蘆筍等農(nóng)產(chǎn)品中都有報(bào)道，嚴(yán)重威脅食品安全及人類和動(dòng)物的健康；另一方面，腐馬素可以誘導(dǎo)植物的細(xì)胞程序化死亡以及過敏性反應(yīng)

2、，在模式植物擬南芥中腐馬素誘導(dǎo)細(xì)胞程序化死亡是研究植物對(duì)化學(xué)脅迫的抗性、植物免疫機(jī)理以及神經(jīng)鞘脂功能的良好體系。本研究中，建立了用于玉米等食品中腐馬素檢測(cè)的HPLC-ELSD方法，分析了我國(guó)不同地區(qū)，特別是食管癌高發(fā)區(qū)玉米和玉米制品上腐馬素污染狀況；結(jié)合LC-MS分析了浙江省蘆筍中腐馬素污染情況；并利用PCR檢測(cè)和產(chǎn)毒培養(yǎng)等方法，研究了玉米及蘆筍中產(chǎn)生腐馬素的原因。此外，以擬南芥為材料，篩選并初步分析了兩個(gè)抗FB1的突變體，同時(shí)研究了芥

3、子油苷在擬南芥對(duì)FB1抗性中的作用。主要研究結(jié)果如下： 利用腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品和野生型串珠鐮刀菌A0149產(chǎn)毒培養(yǎng)玉米為材料，結(jié)合常規(guī)的HPLC-OPA衍生法建立了不需要衍生的快速可靠的HPLC-ELSD方法，腐馬素B1(FB1)在3-24μg之間其物質(zhì)的量與峰面積分別取自然對(duì)數(shù)后有良好的線性關(guān)系，最低檢出限約為60ng，可以同時(shí)檢測(cè)B系列四種腐馬素。利用該方法分析了我國(guó)東北地區(qū)、中東部地區(qū)和東南部地區(qū)玉米中腐馬素的污染水平，結(jié)果表明

4、，腐馬素的整體污染水平較低，只檢出了FB1，中東地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.25-1.8μg/g(平均，0.74μg/g)，檢出率為66.7％(15/24)，東北地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.21-0.29μg/g(平均，0.24μg/g)，檢出率為28.6％(6/21)，東南部地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.30-3.13μg/g(平均，0.47μg/g)，檢出率為30.0％(6/20)。 我國(guó)的河南林縣被認(rèn)為是世

5、界上食道癌發(fā)生與玉米中腐馬素污染密切相關(guān)的地區(qū)之一。我們利用建立的HPLC-ELSD方法，研究了該地區(qū)不同來源和不同表觀特征的玉米，以及不同玉米制品中腐馬素的污染狀況。結(jié)果表明，來自農(nóng)戶、糧倉，中心市場(chǎng)，商店以及超市的共140份玉米樣品中FB1檢出率分別為61.5％(16/26)，50％(12/24)，33.3％(12/36)，17％(2/12)，0％(0/6)。來自糧庫的玉米樣品中腐馬素污染水平最高(0.25-1.80μg/g；平均，

6、0.73μg/g)，其次是來自農(nóng)戶(0,25-1.80μg/g；平均，0.73μg/g)，而來自中心市場(chǎng)(0.25-1.10μg/g；平均，0.51μg/g)和商店較輕(0.22-0.34μg/g；平均，0.28μg/g)。對(duì)80個(gè)來自當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶玉米樣品分析后發(fā)現(xiàn)，24個(gè)霉變玉米樣品中18個(gè)檢出了較高水平的腐馬素B1(0.28-3.30μ/g；平均，1.58μg/g)，而56份外觀健康的玉米中有20份也檢出了腐馬素B1(0.21-0.82

7、μg/g；平均，0.46μg/g)。來自中心市場(chǎng)的115份玉米食品和飼料樣品中，飼料中腐馬素的含量最高(0.30-3.13μg/g；平均，1.50μg/g)，其次是非加工食品(0.31-0.63μg/g，平均，0.47μg/g)，加工食品中污染最輕(0.21-0.28μg/g，平均，0.25μg/g)，其檢出率分別為53.6％，33.3％和17.9％?？傊?，來自林縣地區(qū)的玉米食品和玉米飼料中腐馬素污染水平較低(<2μg/g)，但是對(duì)糧倉

8、和農(nóng)戶貯藏玉米的腐馬素污染還需要采取措施加以控制。 為了研究玉米中腐馬素污染的原因，我們采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子檢測(cè)相結(jié)合的辦法，研究了收集玉米中鐮刀菌的污染狀況，并通過產(chǎn)毒培養(yǎng)方法分析了分離菌株的產(chǎn)毒能力?？傮w看來，玉米樣品中真菌，鐮刀菌和腐馬素產(chǎn)毒菌的污染率分別為42.18％，35.94％和29.69％，其中鐮刀菌和產(chǎn)毒菌分別占總污染菌的74.19％(23/31)和61.29％(19/31)。PCR檢測(cè)和產(chǎn)毒培養(yǎng)結(jié)果表明，共有三

9、種鐮刀菌在玉米培養(yǎng)基上產(chǎn)生了腐馬素，分別為串珠鐮刀菌、再譽(yù)鐮刀菌和膠孢鐮刀菌。產(chǎn)毒能力分析表明，不同菌種之間以及相同菌種的不同菌株之間產(chǎn)毒能力差異顯著，產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒能力從186μg/g到16784μg/g，平均為4637μg/g，其中FB1占主要部分為87.1％(75.8-94.6％，平均產(chǎn)量4041μg/g)；第二類主要毒素為FB2，平均產(chǎn)量為642μg/g，范圍為46-2308μg/g，而且所有的串珠鐮刀菌和再譽(yù)鐮刀菌也都產(chǎn)生FB

10、3，平均產(chǎn)量為189μg/g，范圍為42-711μg/g。不同地區(qū)腐馬素產(chǎn)毒菌株污染狀況不同，其中以中東部地區(qū)污染最重，共從24份樣品中分離到14個(gè)污染菌，其中9個(gè)為產(chǎn)毒菌，而且污染的鐮刀菌種類也最多，除了串珠鐮刀菌外，還有再譽(yù)鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和木賊鐮刀菌；東南部地區(qū)則最輕，從19份樣品中分離到5個(gè)菌株，而且只有一株產(chǎn)毒菌株；東北地區(qū)21份玉米中共分離到12個(gè)菌株，所有的9個(gè)鐮刀菌均為產(chǎn)毒菌株，包括兩個(gè)產(chǎn)毒的膠孢鐮刀菌。我們的研究表明

11、，這些外觀潔凈的食用玉米中仍然存在腐馬素及產(chǎn)毒菌的污染，這可能是采前受到產(chǎn)毒病原菌侵染，但采后過程中可能不適合產(chǎn)毒造成的，由于這些產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒能力較強(qiáng)，如果條件適宜，仍然存在大量毒素污染的可能性。 HPLC-ELSD和LC-MS分析都表明浙江省地區(qū)食用蘆筍樣品中沒有腐馬素污染。從22份蘆筍樣品中共分離到9株再譽(yù)鐮刀菌，5株尖孢鐮刀菌，1株木賊鐮刀菌和1株銳頂鐮刀菌，復(fù)合PCR分析表明，所有的再譽(yù)鐮刀菌均擴(kuò)增出了腐馬素生物合成基因

12、FUM1和FUM8片段，而且其產(chǎn)毒能力較強(qiáng)，在玉米培養(yǎng)基中總腐馬素的平均產(chǎn)量為1603.5μg/g，范圍27.8-4204.0μg/g，產(chǎn)生FB1為148.2-3850.2μg/g(平均，1355.9μg/g)，產(chǎn)生FB2為21.4-543.0μg/g(平均，153.1μg/g)，產(chǎn)生FB3為0-434.2μg/g(平均，106.4μg/g)，其中5株屬于高產(chǎn)毒菌(＞500μg/g)，3株屬于中產(chǎn)毒菌(50-500μg/g)。而其他菌株

13、則只檢測(cè)到鐮刀菌特異的ITS片段，產(chǎn)毒培養(yǎng)和液相分析證實(shí)了存在產(chǎn)毒爭(zhēng)議的尖孢鐮刀菌確實(shí)不能產(chǎn)生FBs。我們的結(jié)果表明，浙江省食用蘆筍中沒有腐馬素的污染，但能夠產(chǎn)生真菌毒素的鐮刀菌污染較重，這些菌株不僅可以引起蘆筍的病害而且可以產(chǎn)生對(duì)人體有害的真菌毒素，應(yīng)引起重視并加以控制。 本研究還建立了一種擬南芥抗腐馬素突變體的篩選方法，利用1μM的FB1培養(yǎng)基從EMS誘變的哥倫比亞生態(tài)型Col-0突變體庫中篩選得到兩株抗FB1的突變體fbr

14、41和fbr42。在正常條件下，兩個(gè)突變體表現(xiàn)出植株矮化，葉片邊緣鋸齒，以及側(cè)根相對(duì)發(fā)達(dá)等異常表型；在1μMFB1培養(yǎng)基上，根毛發(fā)達(dá)，葉片變硬，只在根等部位產(chǎn)生少量活性氧，其抗性遠(yuǎn)強(qiáng)于激素突變體jar1，ein3-1，npr1和轉(zhuǎn)基因NahG，最大FB1抗性濃度在2μM左右；遺傳學(xué)分析表明，fbr41為隱性單基因突變。 10μMFB1外源處理野生型擬南芥Col-0后，HPLC分析表明，短鏈脂肪類芥子油苷含量下降，而長(zhǎng)鏈脂肪類芥子

15、油苷含量略有升高；吲哚基-3-甲基芥子油苷(Indol-3-ylmethylGS，IM)的含量明顯下降，和而4-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷(4-methoxyindol-3-ylmethylGS，41M)和1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷(1-methoxyindol-3-ylmethylGS，1IM)則明顯升高；而長(zhǎng)鏈脂肪類芥子油苷缺失但吲哚類含量高的突變體gsm1-3和所有芥子油苷組分都低的突變體gcc8同樣在FB1處理后被極大地

16、誘導(dǎo)了41M和1IM，而且gsm1-3表現(xiàn)出稍好的抗性，這預(yù)示不是長(zhǎng)鏈脂肪類芥子油苷而可能是4IM和1IM參與了對(duì)FB1的抗性作用。對(duì)芥子油苷生物合成途徑相關(guān)基因分析表明，與抗病相關(guān)的camalexin和IAA生物合成基因(PAD3和NIT2)的表達(dá)在處理與對(duì)照之間沒有明顯差異，而參與吲哚類芥子油苷生物合成的CYP8381卻極大的上調(diào)；此外，我們對(duì)篩選的兩個(gè)擬南芥抗FB1突變體的芥子油苷及其生物合成相關(guān)基因也進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，兩個(gè)突