轉(zhuǎn)Gbvel基因擬南芥對(duì)黃萎菌的抗性和機(jī)制研究.pdf

1、棉花黃萎病是全世界棉花生產(chǎn)上危害最重要的病害之一，目前尚無(wú)有效的藥劑防治措施，被稱為棉花的“癌癥”。目前該病害防控最為有效的方法是抗病育種，然而目前生產(chǎn)上最為多用的陸地棉還缺乏有效的抗病材料，制約了抗病育種的應(yīng)用。通過(guò)定位和克隆抗病基因，研究它們對(duì)黃萎病的抗性及其抗性機(jī)制對(duì)防治黃萎病至關(guān)重要。最近，我們從海島棉“Hai7124”中克隆了番茄抗黃萎病Ve同源的類受體蛋白基因Gbve1，并通過(guò)基因沉默技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明了Gbve1基因?qū)β?/p>

2、葉型和非落葉型的棉花黃萎菌都具有一定抗性;將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥（Arabidopsis）后，發(fā)現(xiàn)擬南芥對(duì)黃萎病的抗性有了明顯增強(qiáng)，表明Gbve1在物種間具有一定的保守性。
　　為了進(jìn)一步研究Gbve1的抗性機(jī)制，本課題篩選了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)Gbve1基因擬南芥和對(duì)照植株Col-0移栽到培養(yǎng)介質(zhì)中后，通過(guò)棉花黃萎菌分生孢子懸浮液灌根法接種，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)病統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)由于Gbve1基因的表達(dá)，擬南芥對(duì)棉花黃萎菌表現(xiàn)抗性增強(qiáng)，而且，對(duì)落

3、葉型V991菌株的抗性差異明顯大于非落葉型菌株BP2。
　　隨后，我們對(duì)轉(zhuǎn)Gbve1基因擬南芥進(jìn)行了比較詳盡的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究。在根部抗性測(cè)定中，采用孢子懸浮液蘸根接種法，并對(duì)接種后的樣品進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)接種24h后，轉(zhuǎn)基因擬南芥根部胼胝質(zhì)積累增多，而對(duì)照植株中沒(méi)有明顯積累。接種48h，轉(zhuǎn)基因擬南芥中有細(xì)胞死亡，對(duì)照植株中沒(méi)有明顯細(xì)胞死亡，大量侵染菌絲聚集。我們采用離體葉片葉背接種法接種兩種擬南芥，發(fā)現(xiàn)接種24h，轉(zhuǎn)基因植株葉片中胼胝

4、質(zhì)沉積明顯顯著多于對(duì)照植株Col-0;采用H2O2測(cè)試盒對(duì)接種各個(gè)時(shí)間段H2O2含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)48h，轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)氧化氫含量迅速上升，達(dá)到一個(gè)峰值，經(jīng)過(guò)DAB染色，此時(shí)間段轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)深褐色斑，而對(duì)照植株只是淺棕色班，說(shuō)明此時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中過(guò)氧化氫含量多于對(duì)照植株。細(xì)胞程序性死亡是抗病反應(yīng)的典型表現(xiàn)，通過(guò)對(duì)48h和72h的接種樣品進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)48h細(xì)胞壞死不明顯，而在72h，二者著色情況差異明顯，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片被染

5、成很深的藍(lán)色，隨即對(duì)其進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)細(xì)胞壞死，對(duì)照植株有大量侵染菌絲出現(xiàn)。本研究分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥的一系列基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)，初步揭示了棉花Gbve1基因可以通過(guò)增強(qiáng)擬南芥的胼胝質(zhì)沉積、過(guò)氧化氫積累及細(xì)胞死亡等途徑，提高對(duì)棉花黃萎菌的抗性。
　　為了更加深入認(rèn)識(shí)Gbve1的作用機(jī)制，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了表達(dá)譜測(cè)序及分析。研究發(fā)現(xiàn)，Gbve1基因的轉(zhuǎn)入及表達(dá)會(huì)引起擬南芥多個(gè)基因的表達(dá)差異性變化，其中1204個(gè)基因上調(diào)