人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向感覺神經(jīng)元誘導(dǎo)研究.pdf

1、第一章人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　建立本實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定分離擴(kuò)增hBMSCs的方案并評(píng)估獲取的細(xì)胞是否為hBMSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　采用直接貼壁法和密度梯度離心法同時(shí)分離hBMSCs，比較原代培養(yǎng)過程中集落出現(xiàn)時(shí)間、集落數(shù)目、P3代細(xì)胞生長曲線;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測P3代細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD45的表達(dá)情況;成骨、成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)所獲得細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞

2、分化，以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結(jié)節(jié)及成脂分化中脂滴的形成。
　　結(jié)果:
　　直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到hBMSCs。直接貼壁法集落出現(xiàn)時(shí)間較密度梯度離心法短，集落數(shù)目多于密度梯度離心法，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于密度梯度離心法;流式細(xì)胞術(shù)檢測直接貼壁法獲得的P3代細(xì)胞CD34陽性率2.18％，CD44陽性率98.14％，CD45陽性率0.41％。成骨誘導(dǎo)后以茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見脂滴形

3、成。
　　結(jié)論:
　　1、直接貼壁法和密度梯度離心法均能分離得到hBMSCs;
　　2、綜合比較集落出現(xiàn)時(shí)間、集落數(shù)目、細(xì)胞增殖能力，直接貼壁法優(yōu)于密度梯度離心法;
　　3、經(jīng)鑒定分離得到的為hBMSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來源。
　　第二章人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向感覺神經(jīng)元樣細(xì)胞分化可行性探討
　　目的:
　　探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向感覺神經(jīng)元誘導(dǎo)的可能性。
　　方法:

4、>　　RT-PCR檢測RA、Shh、Wnt信號(hào)通路相關(guān)RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在獲得的hBMSCs中表達(dá)情況;
　　使用RA、Shh、Wnt1、RA+Shh、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1共7組進(jìn)行感覺神經(jīng)元誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)改變，熒光定量PCR檢測神經(jīng)元相關(guān)基因β-tubulin3、MAP-2

5、、Tau、GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導(dǎo)組及hBMSCs中表達(dá)情況，免疫熒光檢測誘導(dǎo)后感覺神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志GATA-3、Calretinin、Brn3a在各誘導(dǎo)組中表達(dá)情況，比較各組之間差異。
　　結(jié)果:
　　RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在hBMSCs中存在不同程度表達(dá);各誘導(dǎo)組中均可獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞，

6、免疫熒光顯示RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中可見GATA3、Calretinin陽性細(xì)胞，Wnt1組、RA+Wnt1組、Shh+Wnt1組、RA+Shh+Wnt1組中可Brn3a陽性細(xì)胞;熒光定量PCR結(jié)果示β-tubulin3、MAP-2、Tau在各誘導(dǎo)組中均較未誘導(dǎo)組表達(dá)上調(diào)，有顯著性差異，各誘導(dǎo)組之間相對(duì)表達(dá)量無明顯差別。GATA3在RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中較未誘導(dǎo)組增高倍數(shù)較大，分別為24.4倍、68

7、.1倍，兩組與未誘導(dǎo)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，RA+Shh+Wnt1組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Calretinin在RA+Shh組、RA+Shh+Wnt1組中較未誘導(dǎo)組增高倍數(shù)較大，分別為339.2倍、572.9倍，兩組與未誘導(dǎo)組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，RA+Shh+Wnt1組與RA+Shh組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Brn3a在Wnt1、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1組較未誘導(dǎo)組均有顯著性差異，分別增高143.0倍、9

8、4.2倍、132.3倍、424.3倍。
　　結(jié)論:
　　1、培養(yǎng)的hBMSCs中存在RA、Shh、Wnt作用基礎(chǔ);
　　2、Shh和RA單獨(dú)誘導(dǎo)hBMSCs無法獲得GATA3、Calretinin陽性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞，Shh和RA聯(lián)合誘導(dǎo)hBMSCs可獲得GATA3、Calretinin陽性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞，但不能獲得Brn3a陽性細(xì)胞。Wnt1單獨(dú)誘導(dǎo)hBMSCs可獲得Brn3a陽性表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞。RA+Shh+W