EMMPRIN在肺癌介導的抑制成骨分化過程中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是當今全球癌癥死亡的主要原因之一。根據(jù)生物學特點、治療方式及預后等可將肺癌主要分為兩大類:非小細胞肺癌與小細胞肺癌，其中以非小細胞肺癌為主。非小細胞肺癌占85％以上，而其中約30％-40％的非小細胞肺癌患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。目前對于肺癌骨轉(zhuǎn)移的機制研究并不清楚。研究比較深入的為“惡性循環(huán)”學說，一方面，轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細胞表達、分泌眾多細胞因子，作用于骨微環(huán)境，破壞了成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收之間的正常生

2、理平衡;另一方面，骨質(zhì)的破壞也會釋放一系列因子，促進腫瘤細胞的生長、侵襲等。肺癌骨轉(zhuǎn)移可導致一系列包括骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫和神經(jīng)壓迫癥狀等在內(nèi)的嚴重并發(fā)癥，降低患者的生活質(zhì)量。
　　細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)，又稱CD147，是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，為免疫球蛋白超家族一員，能刺激多種基質(zhì)金屬蛋白酶（Matr

3、ix metallo proteinases，MMPs）的表達，促進腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，并能夠通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growthfactor, VEGF)的表達，從而誘導腫瘤血管生成。業(yè)已證實，EMMPIN的高表達與乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的預后密切相關。最近有文獻報道通過上調(diào)EMMPRIN的表達，可加速“惡性循環(huán)”，激活破骨細胞，增強乳腺癌的溶骨性轉(zhuǎn)移，但EMMPRIN

4、對肺癌細胞介導的成骨細胞分化成熟是否起作用并不清楚。
　　本研究旨在研究EMMPRIN在肺癌介導的抑制成骨分化中的作用及可能機制，為臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移防治開辟新的思路。
　　方法:
　　我們采用EMMPRIN過表達、短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒感染非小細胞肺癌A549細胞，建立穩(wěn)定的相應A549細胞系。首先，觀察其對非小細胞肺癌A549細胞自身的增殖、遷移與侵襲等生物學行為的影響，并

5、探討其可能機制。而后，收集相應的肺癌細胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)，與成骨前體細胞MC3T3-E1共培養(yǎng)，觀察其對成骨前體細胞MC3T3-E1成骨分化的影響。最后，我們檢測其對肺癌A549細胞自身的DKK1的表達的影響，并進一步檢測成骨前體細胞MC3T3-E1內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路β-catenin活化的情況。
　　一、EMMPRIN對肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲的影響
　　1

6、.用shRNA干擾EMMPRIN表達的慢病毒、過表達EMMPRIN的慢病毒及陰性對照(negative control，NC)的慢病毒感染肺癌A549細胞，嘌呤霉素篩選。利用RealtimePCR技術(shù)、Western-blot蛋白印跡法分別檢測各組細胞EMMPRIN的mRNA、蛋白表達情況。建立穩(wěn)定EMMPRIN過表達(A549EMP)、干擾EMMPRIN表達(A549shEMP)和陰性對照A549NC細胞。采用CCK-8實驗、劃痕實驗

7、及Transwell小室法分別檢測EMMPRIN對肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響。
　　2.利用Western-blot蛋白印跡法檢測A549EMP細胞、A549shEMP細胞、A549NC細胞與空白對照A549細胞中的β-catenin核表達情況。
　　二、EMMPRIN在肺癌介導的抑制成骨分化中的作用機制研究
　　收集A549EMP細胞、A549shEMP細胞、A549NC細胞與空白對照A549細胞條件

8、培養(yǎng)基，以20％條件培養(yǎng)基的含量制備相應不同組成骨誘導培養(yǎng)基，并與成骨前體細胞MC3T3-E1共培養(yǎng)。
　　1.利用BCIP/NBT染色法檢測相應各組MC3T3-E1細胞ALP活性;
　　2.利用茜素紅S染色檢測相應各組MC3T3-E1細胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況;
　　3.利用realtime PCR技術(shù)檢測相應各組MC3T3-E1細胞Collα1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA的相對表達量;
　　4.利用

9、realtime PCR技術(shù)、Western-blot蛋白印跡法及細胞免疫熒光法檢測相應各組肺癌A549細胞DKK1表達的差異情況;
　　5.利用Western-blot蛋白印跡法檢測相應各組MC3T3-E1細胞中的β-catenin核表達的差異情況。
　　結(jié)果:
　　一、EMMPRIN對肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響
　　1.穩(wěn)定的肺癌A549細胞系的成功建立與A549NC組、空白對照A549組相比

10、，A549EMP組細胞EMMPRIN的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05)，相反，A549shEMP組細胞的EMMPRIN的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05);A549NC組與空白對照A549組相比，EMMPRIN mRNA和蛋白表達水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.EMMPRIN可增強肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲的能力
　　1)與空白對照A549組相比，A549EMP組細胞增殖、遷移與

11、侵襲能力明顯增強(P＜0.05)，而A549shEMP組細胞增殖、遷移與侵襲能力能力明顯降低（P＜0.05）.
　　2)上調(diào)EMMPRIN的表達，可明顯促進A549細胞β-catenin核表達，反之下調(diào)EMMPRIN的表達，可明顯抑制A549細胞β-catenin核表達;
　　二、EMMPRIN在肺癌介導的抑制成骨分化中作用機制的研究
　　1.干擾EMMPRIN表達可減弱肺癌A549細胞條件培養(yǎng)基(CM)介導的抑制成骨

12、分化的能力:
　　1) ALP活性:與陽性對照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細胞ALP活性均明顯減弱;而相比于A549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細胞ALP活性明顯增強，A549NCCM組ALP活性無明顯差異。
　　2)礦化:與陽性對照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯減小;而

13、相比于A549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯增大(P＜0.05)，A549NCCM組MC3T3-E1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積無明顯差異(P＞0.05)。
　　3)成骨相關基因表達:與陽性對照組相比，A549shEMPCM組、A549NCCM組及A549CM組MC3T3-E1細胞成骨分化相關標志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCNmRNA表達水平明顯降低(P＜0.05);而相比于

14、A549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細胞成骨分化相關標志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA表達水平明顯增高(P＜0.05），A549NCCM組MC3T3-E1細胞成骨分化相關標志基因Col1α1、RUNX2/Cbfa1和OCN mRNA表達水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.EMMPRIN可通過影響肺癌A549細胞DKK1的表達，影響成骨前體細胞β-catenin的活化，參與肺癌A

15、549條細胞件培養(yǎng)基(CM)介導的成骨抑制作用
　　1)DKK1的表達:干擾EMMPRIN的表達可顯著下調(diào)肺癌A549條細胞及肺癌A549條件培養(yǎng)基中DKK1的mRNA和蛋白水平(P＜0.05），相反，過表達EMMPRIN可顯著上調(diào)肺癌A549條細胞及肺癌A549條件培養(yǎng)基中DKK1的mRNA和蛋白水平(P＜0.05);
　　2)MC3T3-E1細胞內(nèi)β-catenin核表達:
　　A549shEMPCM組、A549N

16、CCM組及A549CM組MC3T3-E1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯低于陽性對照組(P＜0.05)，而相比于A549CM組，A549shEMPCM組MC3T3-E1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯增高(P＜0.05);A549EMPCM組MC3T3-E1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平與A549shEMPCM組剛好相反，即相比于A549CM組，A549EMPCM組成骨前體細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯增高(P＜