沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后的人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、端粒酶mRNA的影響.pdf

1、背景:成纖維細(xì)胞的異常增生或膠原蛋白的代謝失衡是病理性瘢痕和纖維化疾病致病原因之一[1]。端粒對于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能通過延長縮短的端粒來增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。端粒酶催化亞單位TERT是其關(guān)鍵的限速酶[2]。目前已有研究證明瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞端粒酶活性明顯增高[3]。近年來，沙利度胺在治療纖維化性皮膚病及人類其他臟器的纖維化疾病的相關(guān)報道越來越多，國內(nèi)外已有研究證實(shí)沙利度胺對纖維化性皮膚病及其他臟器的纖維化

2、疾病均有抑制作用[4-5]。在沙利度胺和端粒酶作用的相關(guān)研究中，有結(jié)果顯示沙利度胺可通過下調(diào)hTERTmRNA轉(zhuǎn)錄水平，抑制端粒酶活性來誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖[6]。組胺作為皮膚纖維化疾病活化刺激因素之一，它可促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長、增殖及促進(jìn)膠原蛋白合成[7]，與病理性瘢痕的形成關(guān)系密切[8]。目前，關(guān)于沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞增殖及膠原的表達(dá)的直接影響尚無報道;關(guān)于沙利度胺對經(jīng)組胺刺激活化后成纖維細(xì)胞增殖活

3、性、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及端粒酶的直接影響也未見報道。因此，本研究檢測，經(jīng)組胺刺激后，活化增生的成纖維細(xì)胞在沙利度胺干預(yù)后，對其增殖活性、端粒酶活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的直接作用，以探討沙利度胺在抑制活化后的成纖維細(xì)胞的增殖、降低其端粒酶活性及膠原表達(dá)方面的直接作用，從而研究沙利度胺在抗真皮纖維化的潛在作用，為防止術(shù)后瘢痕形成及對病理性瘢痕的臨床治療和預(yù)后提供新的指導(dǎo)思路。
　　目的:探索沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后的成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ

4、、Ⅲ型膠原蛋白、端粒酶活性的mRNA表達(dá)的直接影響。
　　方法:
　　1、正常真皮成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，并經(jīng)波形蛋白免疫組化染色，行細(xì)胞鑒定，取第4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　2、CCK-8測正常成纖維細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞消化后接種于96孔培養(yǎng)板中，每組均設(shè)置5個重復(fù)孔，各組分別中加入含有濃度分別為0（空白對照組）、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L含沙利度胺的DMEM培養(yǎng)基，用CCK-8法檢測沙利度胺作

5、用24h后細(xì)胞在560nm處的光密度值(OD值)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組及CCK-8測經(jīng)組胺刺激后的成纖維細(xì)胞增殖活性
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（K組）、沙利度胺處理組（S組）、組胺處理組（Z組）、組胺+沙利度胺處理組（Z+S組）。取成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸液，濃度為2×104/ml，每孔200ul接種于96孔板，Z組及Z+S組分別加入200ul100UM的組胺工作液，K組及S組加等量空白培養(yǎng)液，共同培養(yǎng)48小時。

6、棄去各組培養(yǎng)液，S組及Z+S組更換10-5mol/L沙利度胺液，其余兩組加入等量DMEM.每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。采用上述CCK-8法測得OD值，并對以上數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4、采用SYBR GreenⅠ染料法熒光定量PCR測定COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的表達(dá)情況及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　按上述分組要求處理細(xì)胞，每組設(shè)三個樣本，均接種在25mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后提取各組總RNA。應(yīng)用熒光定量PCR對COL

7、-Ⅰ、COL-ⅢmRNA基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，并用以上測得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　5、采用SYBR GreenⅠ染料法熒光定量PCR測定hTERT mRNA的表達(dá)情況及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　按上述分組中Z組、Z+S組要求分別處理得到兩組細(xì)胞，按方法4得到hTERT mRNA基因的表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1、CCK-8的結(jié)果顯示:
　　1.1沙利度胺對人正常真皮成纖維細(xì)胞增殖能力的影響:濃度為0

8、（空白對照組）、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L組OD值分別為:1.1618±0.0783、0.898±0.0461、1.0761±0.0582、1.147±0.050，四個處理組的細(xì)胞活性不全相等(P＜0.05)，組內(nèi)比較結(jié)果顯示:10-3、10-4mol/L濃度沙利度較0組相比，細(xì)胞增殖受到抑制(P＜0.05);10-5mol/L沙利度胺較0組比較，細(xì)胞增殖無明顯差異(P＞0.05)。
　　1.2沙利

9、度胺對組胺誘導(dǎo)后人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性的影響:K組、S組、Z組、Z+S組，各組OD值分別為:1.1618±0.0783、1.147±0.050、1.4182±0.0226、1.186±0.0515，四個處理組的細(xì)胞活性不全相等(P=0.000)，組內(nèi)比較結(jié)果示:Z組較K組細(xì)胞活性增強(qiáng)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;Z+S組較Z組細(xì)胞活性受到抑制，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0.05)結(jié)果提示:10-3mol/L、10-4mo

10、l/L濃度的沙利度胺可明顯抑制正常成纖維細(xì)胞的增殖活性、100UM濃度的組胺可使人正常成纖維細(xì)胞增殖活性升高、10-5mol/L沙利度胺對正常細(xì)胞增殖活性無明顯抑制作用，但對組胺激活后的成纖維細(xì)胞增殖活性有明顯抑制作用。
　　2、沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的影響。
　　K組、S組、Z組、Z+S組所得COL-ⅠmRNARQ值分別為1.0157±0.0025、0.6577±0.0317、1.76

11、93±0.0358、0.2557±0.0235。各組RQ值不全相等(P=0.000)，組內(nèi)比較結(jié)果示，S組較K組成纖維細(xì)胞COL-ⅠmRNA RQ值降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Z組較K組成纖維細(xì)胞COL-ⅠmRNA RQ值明顯升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Z+S組較Z組相比COL-ⅠmRNA RQ值降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果提示:100UM濃度的組胺可使正常人成纖維細(xì)胞COL-1mRN

12、A表達(dá)升高，10-5mol/L濃度沙利度胺對正常成纖維細(xì)胞COL-1mRNA的表達(dá)存在抑制作用，但對組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞的COL-1mRNA的表達(dá)抑制作用更明顯。
　　K組、S組、Z組、Z+S組所得COL-ⅢmRNARQ值分別為:0.988±0.012、0.826±0.018、1.531±0.047、0.746±0.027，對所要研究比較的K組和Z組、K組和S組、Z+S組和Z組所得RQ值分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， Z組較K組COL-ⅢmR

13、NARQ值升高，兩者有顯著差異（P=0.001）;S組較K組COL-ⅢmRNARQ值降低，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);Z+S組較Z組COL-ⅢmRNARQ降低，兩者有顯著差異(P=0.000)，提示100UM濃度的組胺可使正常人成纖維細(xì)胞COL-ⅢmRNA表達(dá)升高，10-5mol/L濃度沙利度胺對正常成纖維細(xì)胞COL-ⅢmRNA的表達(dá)存在抑制作用，但對組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞的COL-ⅢmRNA的表達(dá)抑制作用更明顯。
　

14、　3、沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞hTERTmRNA的影響
　　Z組、Z+S組所得hTERT mRNARQ值分別為:1.850±0.054、0.984±0.043， Z+S組較Z組hTERT mRNARQ值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，提示沙利度胺對組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞hTERTmRNA的表達(dá)有抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)濃度為100UM的組胺誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞增殖活性、COL-Ⅰ、ⅢmRNA的