桑樹青枯病病原菌的分離鑒定及其活體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、由青枯菌5號(hào)生理小種（Ralstonia solanacearumrace5）引起的桑青枯病是我國(guó)一種毀滅性的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，因此早期診斷、盡早防控是控制該病害爆發(fā)流行的重要手段。本研究通過(guò)對(duì)采自廣東發(fā)病桑園病樹根部組織的病原菌進(jìn)行分離鑒定、致病性測(cè)試分離到一株致病力的青枯菌株 RS-5。通過(guò)設(shè)計(jì)的青枯菌5號(hào)小種特異性引物設(shè)計(jì)了熒光定量PCR方法，可有效檢測(cè)青枯5號(hào)小種菌株。通過(guò)使用疊氮溴化丙錠（PMA）對(duì)菌株預(yù)處理，

2、建立了青枯菌5號(hào)小種的活菌檢測(cè)方法。
　　從感染青枯病的桑樹根部組織中分離到了3株具有典型青枯菌形態(tài)的桑青枯病病原菌RS-5，JX-3，GD-3，使用傷根接種法結(jié)合灌根接種法對(duì)三株菌進(jìn)行致病性驗(yàn)證，其中RS-5可引發(fā)桑樹產(chǎn)生青枯癥狀。對(duì)從發(fā)病桑苗中重新分離到的病原菌進(jìn)行了培養(yǎng)形態(tài)觀察和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，該菌與R. solanacearum的同源相似性高達(dá)99％，因而將此菌鑒定為青枯菌。
　　通過(guò)青枯菌5號(hào)小種與

3、其他小種青枯菌的差異片段，篩選到了一對(duì)適宜的青枯5號(hào)小種特異性引物RS-72F/RS-312R，經(jīng)過(guò)電泳驗(yàn)證和片段回收測(cè)序，驗(yàn)證該引物可特異性的擴(kuò)增青枯菌5號(hào)小種DNA上241 bp的特異性片段，而對(duì)于其他小種青枯菌和土壤中其他種屬的微生物均沒(méi)有擴(kuò)增。普通PCR對(duì)青枯菌5號(hào)小種全基因組DNA的檢測(cè)限為50 pg/μL，對(duì)青枯菌5號(hào)小種菌液的檢測(cè)限為1.0×104 CFU/ml。以青枯菌5號(hào)小種全基因組DNA和青枯菌5號(hào)小種菌液為模板進(jìn)行

4、熒光定量PCR檢測(cè)，在10-4~102ng/μL范圍內(nèi)，DNA濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=?2.747x+21.834(R2=0.993)，在103~107 CFU/mL范圍內(nèi)，菌液濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=?3.418x+45.447(R2=0.998)。
　　利用疊氮溴化丙錠（PMA）對(duì)細(xì)菌樣本進(jìn)行預(yù)處理，使用15 ng/μL濃度的PMA，暗孵育10min，強(qiáng)光曝光5 min，可完全抑制1

5、07CFU/mL死菌中的DNA，且不會(huì)對(duì)活菌DNA的擴(kuò)增造成影響，在103~107 CFU/mL范圍內(nèi)，PMA-qPCR的Ct值與菌濃的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-3.477x+47.489,R2=0.997。該方法能從活死菌混合體系中有效分辨出活菌。
　　本研究首次建立了桑樹青枯病病原菌青枯菌5號(hào)小種的活菌檢測(cè)方法，為青枯病的早期檢測(cè)和防控提供了一種新的技術(shù)支持，對(duì)于減少青枯病造成的損失和保障蠶桑行業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要