β-catenin介導(dǎo)的血管生成在吳茱萸堿抗肝癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、常用中藥吳茱萸為蕓香科植物，藥理作用主要表現(xiàn)在對(duì)于心血管系統(tǒng)和胃腸道的影響以及具有一定的抗腫瘤的作用。吳茱萸堿是吳茱萸中所含的一種色胺吲哚類生物堿，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制脂肪細(xì)胞分化、抗炎等作用。有研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿對(duì)宮頸癌、前列腺癌和結(jié)腸癌多種癌癥具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚。
　　抗血管生成的藥物通常可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的入侵，通過(guò)抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的活化，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與血

2、管的發(fā)育和重建關(guān)系密切。β-catenin可通過(guò)血管生成因子、成纖維生長(zhǎng)因子以及E4局部腺病毒等保持自身穩(wěn)定，促進(jìn)血管生成反應(yīng)。血管內(nèi)皮抑制素發(fā)揮抗血管生成作用在某種程度上也是通過(guò)誘導(dǎo)β-catenin退化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　本課題在肝癌中對(duì)吳茱萸堿抗血管生成與β-catenin信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。首先在不同整體動(dòng)物模型、不同肝癌細(xì)胞系上驗(yàn)證吳茱萸堿的抗肝癌效應(yīng);通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吳茱萸堿的抗血管生成作用;利用Western

3、 Blot、Realtime PCR、EMSA等方法在肝癌細(xì)胞中探討β-catenin與血管生成的關(guān)聯(lián)性并觀察吳茱萸堿對(duì)其影響，從而發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿的抗肝癌效果及其分子機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用吳茱萸堿及尋找肝癌有效的早期生物學(xué)標(biāo)志和抗腫瘤藥物提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分吳茱萸堿抗肝癌作用的研究
　　目的:
　　探討吳茱萸堿對(duì)裸鼠肝癌移植瘤發(fā)生發(fā)展及肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力

4、的影響。
　　方法:
　　選取了H22 ICR小鼠和裸鼠肝癌移植瘤模型、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察吳茱萸堿對(duì)模型動(dòng)物移植瘤重、瘤體積、抑瘤率、腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、腫瘤特異性生長(zhǎng)因子(TSGF)以及病理組織學(xué)的影響;另采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)、transwell小室試驗(yàn)等方法檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的影響。
　　結(jié)果:
　　吳茱萸堿對(duì)小鼠或

5、裸鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤率可達(dá)40％以上;移植瘤生長(zhǎng)曲線顯示，治療開(kāi)始到第5天，吳茱萸組即表現(xiàn)出較模型組生長(zhǎng)緩慢，至第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)H22小鼠或裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用;吳茱萸堿能顯著降低小鼠或裸鼠血清中腫瘤標(biāo)記物AFP和TSGF的濃度;病理組織學(xué)檢查提示，吳茱萸堿組小鼠或裸鼠移植瘤壞死程度較模型組明顯，以凝固性壞死為主。在人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型中，吳茱萸堿組裸鼠在接種后，瘤體積生長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束所取

6、瘤組織重量均小于模型組，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;動(dòng)物瘤組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，吳茱萸堿組腫瘤壞死程度明顯高于模型組，提示藥物有明顯的抗肝癌作用。MTT法檢測(cè)顯示吳茱萸堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721均有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加抑制率增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，吳茱萸堿作用于HepG2和SMMC-7721細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞明顯增加。吳茱萸堿20umol/L對(duì)

7、腫瘤細(xì)胞的凋亡率可達(dá)到40％。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示吳茱萸堿能夠抑制HepG2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞的遷移。在顯微鏡下觀察經(jīng)結(jié)晶紫染色后穿透Transwell小室的肝癌細(xì)胞數(shù)量，吳茱萸組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有顯著性。
　　結(jié)論:
　　吳茱萸堿可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且通過(guò)引起肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721周期阻滯和細(xì)胞凋亡而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第二部分吳茱萸堿對(duì)血管生成的影響
　

8、　目的:
　　在細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平較系統(tǒng)地探討吳茱萸堿對(duì)血管生成的影響。
　　方法:
　　觀察不同吳茱萸堿處理分別對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的血管形成和大鼠主動(dòng)脈環(huán)及經(jīng)典的基質(zhì)膠栓形成的影響。
　　結(jié)果:
　　吳茱萸堿可明顯抑制HUVEC微管生成，已經(jīng)完全抑制了HUVEC細(xì)胞小管的形成。同時(shí)，吳茱萸堿可顯著抑制主動(dòng)脈環(huán)在基質(zhì)膠內(nèi)形成的微血管樣結(jié)構(gòu)。在基質(zhì)膠栓模型中，吳茱萸堿可明顯抑制膠栓中的血管生成

9、，HE染色和基質(zhì)膠的免疫組化CD31結(jié)果均顯示，藥物可以在體內(nèi)明顯減少VEGF誘導(dǎo)的血管生成，給藥組血管數(shù)量及血管密度明顯減少。
　　結(jié)論:
　　吳茱萸堿在細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平均可抑制血管生成。
　　第三部分吳茱萸堿抑制β-catenin介導(dǎo)的血管生成
　　目的:
　　探討吳茱萸堿對(duì)肝癌細(xì)胞β-catenin和VEGFa分子的影響及其在抑制血管生成和抗肝癌中的作用，闡明吳茱萸堿抗肝癌的部分分子機(jī)制。

10、　　方法:
　　運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Western Blot和qRT-PCR等方法觀察吳茱萸堿對(duì)肝癌H22和SMMC-7721細(xì)胞的裸鼠肝癌移植瘤組織及肝癌HepG2細(xì)胞β-catenin信號(hào)通路及血管生成相關(guān)因子的影響。
　　結(jié)果:
　　吳茱萸堿組可顯著抑制瘤組織中CD31、CD34、VEGFa、VEGFR1、MMP9及β-catenin蛋白的表達(dá)水平，且對(duì)瘤組織β-catenin mRNA也有一定的抑制。使用不同劑量

11、的吳茱萸堿處理HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)藥物可抑制細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，尤其可明顯抑制β-catenin在核中的表達(dá)。吳茱萸堿可明顯阻滯高表達(dá)Frizzled7及β-catenin激動(dòng)劑LiCl所致肝癌細(xì)胞β-catenin和VEGFa表達(dá)水平的升高;吳茱萸堿處理后的條件培養(yǎng)液可明顯抑制HUVEC細(xì)胞微管生成;另采用EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿可明顯減少β-catenin與VEGFa DNA結(jié)合量，提示吳茱萸堿在肝癌細(xì)胞中可抑制β-cat

12、enin的活化，從而抑制VEGFa的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:
　　吳茱萸堿通過(guò)抑制β-catenin而降低VEGFa轉(zhuǎn)錄活性，從而阻滯血管形成而發(fā)揮抗肝癌作用。
　　綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn):
　　1、吳茱萸堿可抑制小鼠或裸鼠肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且通過(guò)引起肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721周期阻滯和細(xì)胞凋亡而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　2、吳茱萸堿在細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平上均可抑制血管生成。