臍動(dòng)脈血管平滑肌中BKca通道與子癇前期的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的多系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危及孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的生命健康。全身小血管痙攣為該病基本病理變化[1]，其中 BKca通道(Large conductance calcium activated potassium channels，BKca）是調(diào)節(jié)血管舒縮功能中最關(guān)鍵離子通道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）和Western blotting技術(shù)檢測(cè)臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BK

2、ca通道陽(yáng)性率、mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，了解臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKca通道的表達(dá)和功能的改變，探討臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKca通道與子癇前期的關(guān)系。再此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKca通道的改變與胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）的關(guān)系。為探索子癇前期的發(fā)病機(jī)制，并從中尋找有效防治子癇前期及重度子癇前期合并胎兒生長(zhǎng)受限的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　方法：（1）HE和疫組化：收集經(jīng)剖宮產(chǎn)或經(jīng)陰道分娩的臍動(dòng)脈正常妊娠組（

3、NP組）和子癇前期組（PE組）各30例作為研究對(duì)象，快速分離臍動(dòng)脈，部分臍動(dòng)脈用10％甲醛固定（其余臍動(dòng)脈用不同的凍存管分裝，用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)），石蠟包埋，然后分別按照 HE染色和免疫組化步驟逐一進(jìn)行，照相并比較 BKca通道在 NP組和 PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)有何不同。（2）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(QPCR）：提取臍動(dòng)脈血管平滑肌總RNA，測(cè)出 RNA濃度，將適量 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，通過(guò) QPCR反應(yīng)

4、得到相應(yīng)的△Ct值，并換算成ΔΔCt值，ΔΔCt值=病例組ΔCt-正常組ΔCt,計(jì)算出2-△△Ct值進(jìn)行 t檢驗(yàn)分析，比較 NP組和 PE組所檢測(cè)基因 BKcaαmRNA、BKcaβ1 mRNA水平的差異。（3）Western blotting：液氮研磨臍動(dòng)脈組織至粉末狀，加1ml蛋白裂解液提取樣本蛋白；樣本蛋白電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，抗體孵育后，成像系統(tǒng)顯像保存，用Quantity-One軟件測(cè)量灰度值分析，應(yīng)用 SPSS17.0軟進(jìn)

5、行t檢驗(yàn)分析，比較 NP組和PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量的差別。再此基礎(chǔ)上進(jìn)一步比較正常妊娠組、子癇前期組和慢性高血壓合并子癇前期組臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異；比較重度子癇前期合并胎兒生長(zhǎng)受限組及無(wú)胎兒生長(zhǎng)受限組臍動(dòng)脈血管平滑肌中BKcaα亞基、BKcaβ1亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異。結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，P＜0.05，P＜0.01均

6、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:（1）①HE染色:NP組和 PE組各30例均為符合實(shí)驗(yàn)要求的臍動(dòng)脈，HE染色后鏡下觀察，可見(jiàn)臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，肌層稍厚，胞漿紅染，胞核位于中央，單核，藍(lán)染。臍動(dòng)脈在子癇前期疾病狀態(tài)下可能會(huì)出現(xiàn)血管平滑肌排列紊亂，但未見(jiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和動(dòng)脈粥樣硬化。②免疫組化：采用定性、半定量法分析。BKcaα亞基和β1亞基在NP組與PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中均有表達(dá)。BKcaα亞基和β1亞基主要表達(dá)于臍動(dòng)脈血管

7、平滑肌胞膜，部分表達(dá)于胞漿中。BKcaα亞基的陽(yáng)性率在 NP組和PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中無(wú)明顯差異；PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基表達(dá)強(qiáng)度較 NP組明顯增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。（2） QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果:數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量分析，即2-△△Ct法。BKcaα亞基mRNA水平在兩組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.808＞0.05）。與 NP組比較，PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基 mRNA水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P=0.015＜0.05）。（3）Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果：① BKcaα亞基蛋白表達(dá)水平在 NP組和 PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000＞0.05)；與 NP組比較，PE組臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaβ1亞基蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。②正常妊娠組、子癇前期組和慢性高血壓合并子癇前期組：與正常妊娠組比較，BKcaα亞基蛋白表達(dá)水平在三組中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。與正常

9、妊娠組比較，BKcaβ1亞基蛋白表達(dá)水平在子癇前期組臍動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)明顯上調(diào)；在慢性高血壓合并子癇前期組臍動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)明顯下調(diào)；與子癇前期組比較，BKcaβ1亞基蛋白表達(dá)水平在慢性高血壓合并子癇前期組臍動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)水平下調(diào)更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1＜0.05，P2＜0.05，P3＜0.01）。③比較重度子癇前期合并胎兒生長(zhǎng)受限組和無(wú)胎兒生長(zhǎng)受限組：BKcaα亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量在兩組中表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.0

10、5）；BKcaβ1亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量在重度子癇前期合并胎兒生長(zhǎng)受限臍動(dòng)脈血管平滑肌中表達(dá)水平有所下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）。
　　結(jié)論：（1）臍動(dòng)脈在子癇前期疾病狀態(tài)下，會(huì)出現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞排列紊亂，但未見(jiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和動(dòng)脈粥樣硬化。（2）PE組與 NP組比較，臍動(dòng)脈血管平滑肌中 BKcaα亞基的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），BKcaβ1亞基表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。提示BKcaβ1亞基的改變可能與 PE