含雙病原物誘導啟動子植物安全表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化及表達活性分析.pdf

1、植物抗病基因工程是植物抗病育種常用的工具之一,利用病原物誘導啟動子驅(qū)動功能基因以提高植物的抗病性比組成型啟動子有明顯的優(yōu)勢。植物在環(huán)境中經(jīng)常同時遭受不同病原物的為害,因而植物需要廣譜的抗病性。由于單個啟動子受誘導因子譜的限制,利用單一病原物誘導啟動子驅(qū)動功能基因的表達,對入侵病原物的打擊范圍是有限的。 本研究把兩個具有高度病原物誘導特異性的啟動子EAS4和hsr203J構(gòu)建到同一個植物表達載體上,通過對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,分析轉(zhuǎn)基因

2、植株中啟動子的誘導表達活性,說明串聯(lián)兩個啟動子,可以增加誘導因子的范圍,擴大轉(zhuǎn)基因植物的抗病譜,這對于抵抗幾種病原物的侵染尤其有重要意義。同時,出于對轉(zhuǎn)基因安全性的考慮,利用兩個T-DNA邊界將目的基因與抗生素抗性基因分開,通過轉(zhuǎn)基因植株的后代自交分離,獲得了只含目標基因而不含抗生素標記的轉(zhuǎn)基因植株。所得結(jié)果如下： 1、構(gòu)建了含雙病原物誘導啟動子的植物表達載體,并對煙草進行了遺傳轉(zhuǎn)化 以pCAMBIA2301為基本構(gòu)架,

3、選用兩個來自煙草的、具有高度病原物誘導特異性的啟動子EAS4和hsr203J替換驅(qū)動uidA(報告基因GUS)基因表達的CaMV 35S啟動子。為了分析串聯(lián)的兩個啟動子活性是否有位置效應,同時構(gòu)建啟動子串聯(lián)次序不同的兩種植物表達載體HPl+EP2(hsr203J+EAS4+uidA)和EP1+HP2(EAS4+hsr203J+uidA),并分別以單啟動子hsr203J和EAS4驅(qū)動uidA為對照,構(gòu)建了四個表達載體。通過農(nóng)桿菌介導的葉盤

4、轉(zhuǎn)化法將表達載體轉(zhuǎn)化煙草。對200株抗生素抗性植株進行PCR篩選,共獲得152株P(guān)CR陽性植株。 2、轉(zhuǎn)基因植株中啟動子表現(xiàn)明顯的誘導表達活性,雙啟動子比單一啟動子表現(xiàn)更強的誘導表達活性 為檢測轉(zhuǎn)基因植株中啟動子的誘導表達活性,從RNA水平、GUS的定性、定量檢測等方面,對不同病原物誘導的啟動子活性進行了研究。 2.1 隨機選取30株P(guān)CR檢測呈陽性的植株,用激發(fā)子parasiticein處理后提取誘導部位組織的

5、總RNA,經(jīng)RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)24株(80％)獲得了與GUS基因預期大小一致的特異性片段,表明這些轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因經(jīng)誘導后可在轉(zhuǎn)錄水平上表達。 2.2 選取14株RT-PCR呈現(xiàn)陽性的植株,分別用煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianea)、煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)和激發(fā)子parasiticein等誘導處理,經(jīng)組織化學染

6、色發(fā)現(xiàn),在檢測的植株中,除單一啟動子ESA4不受灰霉菌誘導外,經(jīng)其它病原物處理的植株都不同程度地被染成藍色,而清水處理的葉片幾乎沒有顏色變化或僅有很輕微的背景色,表明,本研究所構(gòu)建4個表達載體中,啟動子都具有病原物誘導表達的活性,并且,雙啟動子較單啟動子表現(xiàn)出更為廣泛的誘導譜。 2.3 為明確單、雙啟動子是否存在誘導表達量的差異,用熒光法對GUS基因的誘導表達活性進行了定量檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)P。nicotianea、R

7、.solanacearum和激發(fā)子parasiticein誘導后6h,雙啟動子HP1+EP2的誘導表達活性比單啟動子hsr203J高5.9-8.0倍,比EAS4高6.7-7.9倍；雙啟動子EP1+HP2比單啟動子hsr203J的誘導表達活性高5.0-5.7倍,比EAS4高4.7-6.5倍,雙啟動子與單啟動子的活性差異均達極顯著水平。雙啟動子HP1+EP2和EP1+HP2的誘導表達活性也存在極顯著差異,而兩個單啟動子HP1和EP1之間沒有

8、明顯差別。 2.4 同時,用熒光法對GUS的誘導表達活性進行了動態(tài)檢測,發(fā)現(xiàn)雙啟動子HP1+EP2的誘導表達高峰一般出現(xiàn)在誘導后6-10h,而雙啟動子EP1+HP2的活性高峰一般在誘導后8-14h。在檢測的時間范圍內(nèi),雙啟動子的誘導活性始終高于單一啟動子。 這些結(jié)果說明,本研究所構(gòu)建的4個載體中,啟動子都具有病原物誘導表達活性,都可被多種病原物誘導表達。雙啟動子不僅有更廣泛的誘導表達譜,而且誘導表達活性顯著高于單啟動子。

9、 3、轉(zhuǎn)基因株系在T1代可以實現(xiàn)NPTII基因與功能基因uidA的自由分離,獲得不含抗生素標記的、安全的轉(zhuǎn)基因后代 抗生素標記是轉(zhuǎn)基因植物安全性所關(guān)注的重要內(nèi)容之一,出于對轉(zhuǎn)基因植物安全性的考慮,在載體設計時引入了雙邊界序列,把卡那霉素抗性基因NPTII表達盒和uidA基因表達盒分開在不同的T-DNA區(qū),通過轉(zhuǎn)基因植株后代的自交分離,篩選獲得只含目的基因而不含NPTII的轉(zhuǎn)基因植株。 首先對14個轉(zhuǎn)基因株系的T1

10、代幼苗用含卡那霉素的平板進行了表型檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),13個株系的NPTII基因的分離比平均為2.89:1,接近3:1,表明這13個株系中NPⅢ基因可能為單拷貝插入。 為檢測NPTII基因與uidA在T1代中是否發(fā)生自由分離,從13個NPTII單拷貝株系的T1代植株中隨機選取130株,提取基因組DNA,PCR法對其NPTII基因和uidA基因同時進行擴增,結(jié)果是：只含uidA基因的植株占被擴增整體的20.77％,只含NPTII基因的