氧化應激和EndMT參與心房纖維化致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的實驗研究.pdf

1、目的:
　　心房纖顫(atrial fibrillation)在臨床上較為普遍，隨全社會老齡化進程逐日加劇，其發(fā)病率節(jié)節(jié)攀升，嚴重阻礙了人類健康的發(fā)展。究其關鍵點對是房顫發(fā)生和維持的分子機制研究不夠透徹。
　　目前，房顫基礎研究所涉及的主要分子機制包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、自主神經(jīng)功能異常以及離子通道改變等。近幾年，結(jié)構(gòu)重構(gòu)領域得到了更多的關注，尤其是氧化應激和纖維化的相關機制。機體在正常狀態(tài)下能夠產(chǎn)生抗氧化酶如SOD、MDA等

2、來清除多余的ROS，使體內(nèi)自由基的含量處于一個穩(wěn)態(tài)。氧化應激發(fā)生時，機體內(nèi)過度氧化導致細胞損傷，產(chǎn)生過量的ROS，致肌漿網(wǎng)膜受損，使胞漿鈣濃度升高，心房肌纖維溶解，導致結(jié)構(gòu)重構(gòu)，其細胞超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為心肌纖維化。無論是動物模型、臨床標本還是細胞水平，均證實導致房顫治療后復發(fā)的重要原因之一是心肌纖維化改變，而成纖維細胞是纖維化發(fā)生的主要效應器細胞，而心肌成纖維細胞來源不明確，以及多種病理條件下不同來源成纖維細胞組成的變化尚不清楚，故明確其來

3、源，阻斷心房纖維化進程是近年來房顫基礎研究領域的熱點科學問題。近來發(fā)現(xiàn)通過心內(nèi)膜和微血管內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)可能是心肌中成纖維細胞的重要來源，即內(nèi)皮細胞在刺激因素如壓力負荷、炎癥介質(zhì)等作用下難以維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，向間質(zhì)轉(zhuǎn)變、增生為成纖維細胞的過程。且病理狀態(tài)下，成纖維細胞具有更強的促纖維化能力，加快了心房肌纖維化進程，參與心臟重構(gòu)的過程。
　　本研究擬通過觀察氧化應激標志物在兩組患者右房組織及血清中的表達來探討氧

4、化應激在房顫心房重構(gòu)中的作用和意義，并在患者的心房肌組織中檢測α-SMA、S100A4、CD31mRNA和蛋白的表達變化來驗證EndMT參與心房纖維化以及其在心房重構(gòu)中的作用，研究結(jié)果期望為房顫的臨床干預提供新的干預靶標。
　　方法:
　　第一部分:氧化應激標志物在房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的變化和意義
　　研究對象:回顧性分析新橋醫(yī)院心血管外科2014年2月至5月入院，經(jīng)常規(guī)心臟超聲檢查診斷為單純二尖瓣病變的風濕性心臟病

5、患者44例，根據(jù)病史及術前心電圖記錄分為2組。持續(xù)房顫組（AF組）26例，定義為房顫發(fā)作48h以上不能自動轉(zhuǎn)復，需藥物等其他手段干預，持續(xù)時間≥6月，平均年齡（53.30±8.81）歲;竇性心律組（SR組）18例，定義為從未發(fā)生過房顫，平均年齡(50.37±13.03)歲。排除標準:①合并冠心病、糖尿病、肝腎功能不全、甲功亢進或甲狀腺功能減低、惡性腫瘤、心肌病等;②術前6月內(nèi)服用過任何類型的ACEI和ARB類藥物;③三尖瓣返流中度及以上

6、（定義為三尖瓣返流面積≥3cm2）;④房顫持續(xù)時間小于6個月;⑤年齡小于18歲或大于80歲;
　　組織標本采集:在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流開始前，切取部分右心耳組織，剪去多余的脂肪組織后置入-80℃冰箱待測;另于每組標本中隨機抽取5例置于4％多聚甲醛溶液中固定24-36 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（6-8張，片厚5μ m），用于Masson染色及免疫組化染色、免疫熒光染色。觀察心房纖維化情況，以及NOX2蛋白在右房組織的表達。
　　血液

7、標本采集:手術前一天抽取患者靜脈血3ml，于室溫放置2小時待上下分層后于4℃1000 x g離心15分鐘，小心吸取上清液，仔細標記并分裝于2個EP管中，于-80°冰箱中保存，取出使用時需要再次離心。
　　Masson染色:檢測心房纖維化。
　　免疫組化和免疫熒光染色:檢測兩組患者心房組織內(nèi)NOX2蛋白的表達變化。
　　ELISA法:對右心耳組織及血清中氧化應激水平進行測定。
　　第二部分:EndMT參與心房纖維化

8、在風濕性心臟病合并AF患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的意義
　　研究對象:選取2014年7月份至10月份，在新橋醫(yī)院心外科入院的42例接受單純二尖瓣置換術的風濕性心臟病患者，納入和排除標準同第一部分，根據(jù)病史和術前24小時心電圖記錄分為2組:慢性房顫組(AF組)22例，竇性心律組(SR組)20例，分組標準同第一部分。術前行心臟多功能彩超測定各心腔大小及評價心功能。
　　標本采集:在開胸手術體外循環(huán)轉(zhuǎn)流前，切取右心耳組織約200mg，剪去

9、多余的脂肪組織后，將同一標本分成三部分;一部分用4％多聚甲醛溶液固定24-36h后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片5-6張（片厚約6um）;一部分迅速置入-80℃冰箱，以備提取組織總RNA和蛋白;一部分用OCT劑包埋，置入-80℃冰箱，或立即行冰凍切片，用于免疫熒光雙標染色。
　　Masson及Sirius-Red:觀察兩組患者心房纖維化程度。
　　RT-qPCR:檢測兩組患者心房組織中α-SMA、CD31、S100A4 mRNA含量

10、變化。
　　Western blot:檢測兩組患者心房組織中α-SMA、S100A4蛋白的差異性表達。
　　免疫組化、免疫熒光雙標染色:檢測兩組標本中α-SMA、CD31、S100A4蛋白表達差異的情況。
　　結(jié)果:
　　1.第一部分氧化應激和心房重構(gòu)的相關結(jié)果:
　　(1)基線特征比較:AF組:男性7/26例，女性19/26例，SR組:6/18例，女性12/18例，AF組患者左房內(nèi)徑(LADd)明顯大于S

11、R組[(55.57±10.76) vs(43.94±6.21)，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計學意義;AF組左室射血分數(shù)(LVEF)顯著低于SR組[(63.12±7.66) vs(67.83±4.62)，P＜0.05]，AF組左房血栓和腦梗的發(fā)生率明顯高于SR組[11％ vs6％;2％ vs0％, P＜0.05]。
　　(2)兩組患者的免疫組化結(jié)果:AF組NOX2陽性細胞面積area明顯高于SR組[(32005.72±8885.11)

12、 vs(6438.32±2849.63)，P＜0.05]，AF組積分光密度值高于SR組[(4705559±1225040) vs(1213255±421952)，P＜0.05]，相比有統(tǒng)計學差異
　　(3)兩組患者ELISA結(jié)果:AF組右心耳組織內(nèi)ROS[(18.53±3.47) vsf(13.65±3.69),P＜0.01],SOD[(13.32±1.25) vs(10.65±1.15),P＜0.05]、MDA[(15.41±1

13、.69)vs(11.46±1.83)，P＜0.01]AOPP[(29.69+2.09) vs(21.94+1.94)，P＜0.01]的表達明顯高于SR組。AF組血清中ROS含量[(34.6+2.61)vs(17.8+1.03)，P＜0.05]明顯高于SR組，AOPP含量[(13.64+2.56) vs(13.27+3.38),P＞0.05]與SR組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.第二部分EndMT參與房顫心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的相關結(jié)果

14、r>　　(1)心肌間質(zhì)纖維化的觀察:masson染色和苦味酸天狼星紅染色發(fā)現(xiàn):AF組與SR組相比，右房組織膠原纖維增生明顯，特別是Ⅰ型膠原纖維，CVF顯著增高(P＜0.05);
　　(2)免疫熒光雙標染色:通過激光共聚焦技術檢測AF組患者可見心肌間質(zhì)微血管內(nèi)皮有S100A4、CD31兩種蛋白熒光強陽性表達，而SR組只有CD31表達，S100A4蛋白表達較弱或沒有表達。
　　(3)免疫組化染色:兩組患者右房心肌組織中均有S10

15、0A4、α-SMA、V蛋白表達，AF組呈強陽性表達，SR表達較弱。
　　(4)實時熒光定量PCR檢測:AF組患者右心房組織中S100A4、α-SMA mRNA表達均顯著高于SR組(P＜0.05)，而AF組心房組織中CD31 mRNA表達低于SR組(P＜0.05);
　　(5)免疫印跡實驗檢測:AF組患者右心房組織中S100A4、α-SMA蛋白表達顯著高于SR組(P＜0.05);
　　結(jié)論:
　　1.房顫時左房內(nèi)徑

16、增大更明顯，射血分數(shù)減低，左房血栓及腦栓塞發(fā)生率明顯增高，而且發(fā)生了以心房纖維化為主的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
　　2.氧化應激分子標志物表達升高，以心房組織顯著，表明氧化應激和心房纖維化密切相關，提示可能存在NADPH氧化酶/NOX2↑一體內(nèi)氧化應激/炎癥介質(zhì)增加一纖維化改變-結(jié)構(gòu)重構(gòu)一房顫易感性增強這一鏈式反應。
　　3.EndMT參與了心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房肌組織中內(nèi)皮細胞可轉(zhuǎn)為化成纖維細胞參與心房纖維化，表現(xiàn)為成纖維細胞特異性標志物α