快速心房起搏早期兔心房肌電生理重構(gòu)和維拉帕米作用的實驗研究.pdf

1、背景與目的；心房顫動(atrialfibrillation，AF)是臨床上常見的心律失常，發(fā)病率隨著年齡的增長而顯著增加，隨著社會老齡化進(jìn)程，房顫已經(jīng)成為影響人民健康的重要公共衛(wèi)生問題。 1995年，Wijffels等發(fā)現(xiàn)快速心房激動能引起心房電生理功能的改變，促使房顫的發(fā)生和維持，這一過程稱之為“心房電重構(gòu)”，而心肌細(xì)胞膜各種離子通道特別是鉀、鈣通道分布、功能及特性的改變是心房電生理重構(gòu)的始動因素，這些因素改變導(dǎo)致了心房電活動

2、的不穩(wěn)定，從而有利于AF的發(fā)生和維持，尤其是L-型鈣離子通道介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載在心房電重構(gòu)中的作用已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。目前對房顫早期的細(xì)胞和分子電生理改變機(jī)制并不清楚；對快速激動誘發(fā)的心房電重構(gòu)有決定作用的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，目前大多數(shù)證據(jù)都是間接的，直接證實快速起搏對細(xì)胞游離鈣影響的實驗有待進(jìn)一步完成。因此，對AF發(fā)生和維持的分子機(jī)制有必要進(jìn)行深入細(xì)致的研究，進(jìn)而為進(jìn)一步揭示房顫的發(fā)生機(jī)制以及為房顫的臨床治療提供理論依據(jù)。 方法；本課

3、題利用家兔建立快速心房起搏(rapidatrialpacing，RAP)模型，首先觀察快速心房起搏對心房肌超微結(jié)構(gòu)的影響，尋找細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載的直接證據(jù)，了解L-型鈣通道介導(dǎo)的鈣超載參與心房電重構(gòu)的可能機(jī)制；按照快速心房起搏的時間隨機(jī)分組：對照組(P0)，P3，P6，P12，P24，P48組；分離快速心房起搏后不同時相點心房肌細(xì)胞，利用全細(xì)胞膜片鉗測定不同起搏時間對細(xì)胞ICa-L和Ito的影響，同時利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)游離

4、鈣的濃度變化；運(yùn)用RT-PCR和WesternBlot檢測快速心房起搏對家兔心房肌細(xì)胞L-型鈣通道和鉀通道Kv4.3功能亞單位mRNA和蛋白表達(dá)的影響；對比研究通道表達(dá)和離子電流改變的時程關(guān)系；并利用L-型鈣通道阻滯劑維拉帕米(0.2mg/kg，iv)進(jìn)行干預(yù)，探討其對快速心房起搏致心房電生理重構(gòu)的作用。并且對所得結(jié)果采用SPSS10.0軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果本研究主要結(jié)果如下： 1.利用成年家兔，通過頸外靜脈

5、穿刺植入電極，X線透視將電極定位右心房建立RAP模型，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，更容易模擬房顫發(fā)生早期的電重構(gòu)改變。對RAP不同時相的心房組織進(jìn)行病理學(xué)形態(tài)分析和超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)HE染色見RAP后P12和P24組心房肌組織間質(zhì)水腫，肌纖維排列稍紊亂，橫紋不清楚，個別胞漿空泡化，散在炎細(xì)胞浸潤。 (2)超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：RAP6h后可見收縮帶出現(xiàn)，肌纖維排列欠整齊，部分線粒體腫脹，核膜斷裂，凹陷。在起搏12h可見

6、線粒體腫脹，變形，嵴排列紊亂，肌絲溶解和糖原聚集。起搏24h可見線粒體明顯變形，部分嵴膜破裂，大量空泡形成和糖原顆粒聚集更加明顯。 2.分離RAP不同時相點的心房肌細(xì)胞，利用差速貼壁法進(jìn)行純化，免疫熒光染色(FITC與Cy3法)對心房肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對快速心房起搏不同時相點心房肌細(xì)胞ICa-L和Ito進(jìn)行測定，計算電流密度。以Fluo-3/AM為細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑，運(yùn)用激光共聚焦技術(shù)測定了RAP后不同時相點心

7、房肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)心房肌細(xì)胞的分離和鑒定：使用Ⅱ型膠原酶和XIV蛋白酶結(jié)合組織塊消化法分離成年家兔心房肌細(xì)胞，提高了心房肌細(xì)胞的分離效率；同時減少了細(xì)胞分離過程中的損傷因素，得到的細(xì)胞桿狀比例高，形態(tài)典型，橫紋清楚；同時利用差速貼壁法進(jìn)行純化，利用α-sarcomeric-actin抗體進(jìn)行染色鑒定，純度可達(dá)90％以上，滿足了后續(xù)實驗的需要。 (2)鈣離子電流密度的改變：在對照組的細(xì)胞中記錄

8、到了典型的、較高密度的內(nèi)向鈣離子電流，在P3組，記錄到的ICa,L開始顯著減少，在P48組，僅有很小的ICa,L可以記錄到。在-10mV水平，在RAP3h后，電流密度與對照組相比差異顯著，分別為-8.36±0.70pA/pF和-6.77±0.56pA/pF，P12組電流密度為-5.37±0.39pA/pF，與對照組相比差異顯著，隨著起搏時間的延長，離子電流的密度進(jìn)一步下降。 (3)鉀離子電流密度的改變：在+50mV水平，P6組和

9、P12組的外向鉀電流密度并沒有改變，在RAP24h之后，電流密度減少了40％，達(dá)到37.74±3.21pA/pF，與對照組相比顯著減少，而隨著心房起搏的進(jìn)行，在P48組Ito并沒有進(jìn)一步減少。 (4)激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果：RAP6h后細(xì)胞內(nèi)鈣熒光信號開始顯著增強(qiáng)，隨著起搏時間的延長，熒光信號進(jìn)一步增強(qiáng)，說明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐步升高，但在快速心房起搏48h時，細(xì)胞內(nèi)鈣熒光信號與24h時相比無統(tǒng)計學(xué)意義。 3.通過建立家

10、兔RAP模型，對RAP早期兔心房肌L-型鈣通道功能亞單位α1，α2，β1和鉀通道Kv4.3的mRNA表達(dá)利用RT-PCR進(jìn)行檢測；利用免疫組織化學(xué)法和Westernblot對α1及Kv4.3的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，并分析電流密度的改變與離子通道表達(dá)改變之間的相關(guān)性。同時使用維拉帕米進(jìn)行干預(yù)(0.2mg/kg，iv)，利用RT-PCR和WesternBlot對L-型鈣通道α1亞單位的mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，探討L-型鈣通道阻滯劑對快速心

11、房起搏致電生理重構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)L-型鈣通道亞單位α1的mRNA在快速起搏3h無變化。起搏6h后起表達(dá)水平下調(diào)18.82％，為0.69±0.03，并隨著起搏的進(jìn)行表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，但P24與P48相比無顯著差異。蛋白的表達(dá)與mRNA變化相平行，在起搏12、24、48h的蛋白表達(dá)水平分別是63％、46％、44％。而在快速起搏6h后，L-型鈣通道的β1亞單位的mRNA的表達(dá)首次出現(xiàn)下調(diào)，并隨著起搏時間的延長而持續(xù)下調(diào)。α2

12、亞單位的mRNA的表達(dá)在各個時相點都沒有發(fā)生變化。 (2)鉀通道Kv4.3的mRNA表達(dá)在RAP12h后沒有改變，但在24h后mRNA的表達(dá)顯著下降達(dá)到一個平臺期，在RAP的24h和48h下降分別達(dá)54.02％和58.62％。蛋白的表達(dá)從24h后也開始下降，在起搏24h、48h的蛋白表達(dá)水平分別下降28.79％、37.88％。 (3)離子電流的改變與通道功能亞單位表達(dá)的關(guān)系和相關(guān)性分析： L-型鈣通道電流：快速心

13、房起搏3h后，ICa,L被發(fā)現(xiàn)首次出現(xiàn)顯著減少，這種改變早于α1、β1亞單位的減少。L-型鈣離子通道α1亞單位的mRNA和蛋白表達(dá)下降出現(xiàn)在RAP6h后。在起搏48h后除α2外所有亞單位的mRNA表達(dá)均出現(xiàn)下降，這可能是導(dǎo)致出現(xiàn)ICa,L持續(xù)減少的主要原因。 瞬時外向鉀電流：Ito的減少主要與Kv4.3的mRNA和蛋白的表達(dá)下降相平行，開始于快速心房起搏24h以后。兩種變化參數(shù)在快速心房起搏24h以后達(dá)到一個平臺期，在起搏48h

14、組并沒有發(fā)生進(jìn)一步減少。 (4)維拉帕米預(yù)處理組中L-型鈣通道α1亞單位的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)開始下降出現(xiàn)在RAP24h后，要明顯遲于單純RAP組。隨著起搏時間的延長，其表達(dá)水平繼續(xù)下調(diào)，但下降幅度比單純RAP組要小，說明維拉帕米對快速心房起搏導(dǎo)致的L-型鈣通道表達(dá)有一定的保護(hù)作用，但對RAP24h以上的較長時間心房快速激動引起的通道表達(dá)下調(diào)，其保護(hù)作用明顯減弱。 結(jié)論 1.利用家兔頸靜脈穿刺植入電極建立RAP

15、模型穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。 2.快速心房起搏可以導(dǎo)致心房肌出現(xiàn)電生理重構(gòu)，主要表現(xiàn)： ①心房肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了鈣超載：超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為線粒體腫脹、嵴溶解、空泡化；激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)RAP后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。 ②心房肌細(xì)胞的離子電流ICa,L和Ito密度在RAP后均出現(xiàn)減少。 ③心房肌L-型鈣通道主要功能亞單位α1、β1以及鉀通道Kv4.3的mRNA和蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。 3.快速心房起搏致心房肌電

16、重構(gòu)的可能機(jī)制： RAP后心房肌細(xì)胞通過即早調(diào)節(jié)機(jī)制減低L-型鈣電流，從而減少通過L-型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載；隨著RAP的進(jìn)行，心房肌細(xì)胞通過后續(xù)機(jī)制下調(diào)編碼L-型鈣通道主要功能亞單位的mRNA與蛋白表達(dá)，使得離子通道數(shù)量減少，進(jìn)而持續(xù)減少L-型鈣電流，防止細(xì)胞進(jìn)一步鈣超載。 4.維拉帕米能減少通過L-型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子而減輕/延緩細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，從而發(fā)揮對心房肌細(xì)胞電重構(gòu)的保護(hù)作用，但對