橘皮竹茹湯及甘草瀉心湯質(zhì)量表征方法研究.pdf

1、中藥復(fù)方湯劑是中醫(yī)用藥的常見形式，但是傳統(tǒng)湯劑的煎煮、攜帶不便，標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一，影響其臨床應(yīng)用，因此簡便易用、滿足現(xiàn)代生活節(jié)奏的經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)顆粒的研發(fā)意義重大。為此，2013年“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項啟動了“經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)顆粒研究”的課題，由仲景宛西制藥股份有限公司等6家企業(yè)聯(lián)合有關(guān)專家開展包括橘皮竹茹湯與甘草瀉心湯在內(nèi)的20個經(jīng)典名方顆粒劑的示范性研究開發(fā)，目標(biāo)是在遵循傳統(tǒng)煎煮方法、堅持“原汁原味”特點的同時，研究建立現(xiàn)代生產(chǎn)工藝

2、和質(zhì)量控制方法，生產(chǎn)出經(jīng)典名方的現(xiàn)代化產(chǎn)品，既標(biāo)準(zhǔn)顆粒。而該項工作的關(guān)鍵是保證經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)顆粒與其傳統(tǒng)湯劑物質(zhì)基礎(chǔ)的基本一致，從而滿足兩者在處方、治療病癥和用法上基本相同的要求，為標(biāo)準(zhǔn)顆粒的免臨床提供依據(jù)。為保證標(biāo)準(zhǔn)顆粒在處方、療效和用法上與傳統(tǒng)湯劑的一致，急需建立完善的經(jīng)典名方傳統(tǒng)湯劑質(zhì)量表征方法。本課題組以橘皮竹茹湯為研究對象，在保持原方、原劑量、原煎煮方法、原適應(yīng)癥的基礎(chǔ)上開展了該傳統(tǒng)湯劑的質(zhì)量表征方法研究。參照傳統(tǒng)湯劑建立基準(zhǔn)湯

3、劑后，按照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)要求，并結(jié)合中藥自身藥效物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜多樣和整體成分發(fā)揮作用的特點，建立指紋圖譜整體控制結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定的質(zhì)量表征方法，對標(biāo)準(zhǔn)顆粒的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支撐。
　　橘皮竹茹湯出自《金匱要略》，處方中包括橘皮、竹茹、大棗、甘草、人參、生姜等六味藥材，有著廣泛的臨床應(yīng)用且療效顯著?，F(xiàn)在已有公司著手開展橘皮竹茹湯顆粒的研發(fā)工作，但橘皮竹茹湯或其中成藥于中國藥典中未見記載，沒有可以借鑒的物質(zhì)表征方法或質(zhì)控手段。

4、r>　　本文在傳統(tǒng)湯劑的基礎(chǔ)上建立了保持原方、原劑量、原煎煮方法的基準(zhǔn)湯劑制備方法。依原方記載，取橘皮15 g，竹茹15 g，大棗12.5 g，甘草6 g，人參3 g，生姜9 g，加水2000 mL，浸泡30 min，閉蓋煮沸，開蓋以武火煎煮濃縮至600 mL后停止煎煮，減重約1250 g。隨后將湯劑冷凍并在真空中干燥得到總方凍干粉。為了避免樣品中等極性部位化學(xué)成分的損失，對總方凍干粉選用了醇沉的方法進(jìn)行處理處理。將總方凍干粉用75％乙

5、醇處理后，得中等極性部位與多糖部位，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　隨后將橘皮竹茹湯中等極性部位冷凍干燥后所得的凍干粉進(jìn)行HPLC分析，對樣品的前處理方法、流動相、柱溫、梯度等條件進(jìn)行了摸索，建立了橘皮竹茹湯中等極性部位的指紋圖譜，對橘皮竹茹湯基準(zhǔn)湯劑中等極性部位物質(zhì)基礎(chǔ)的整體評價。在得到橘皮竹茹湯指紋圖譜后，通過將其與對照品溶液對照的方法對樣品進(jìn)行定性鑒別，推測出橘皮竹茹湯中等極性部位指紋圖譜中的3個特征色譜峰，即橙皮苷、甘草苷、甘

6、草酸。同時將橘皮竹茹湯HPLC圖分別與其組方中各單味藥HPLC圖相比較，通過比對色譜峰的保留時間，推斷出色譜峰的可能藥材來源，并采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合對照品對照的方法對橘皮竹茹湯中等極性部位樣品中的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了定性鑒別。
　　對橘皮竹茹湯多糖部位，根據(jù)課題組多年經(jīng)驗采用“TFA全水解-PMP柱前衍生化”的方法對樣品進(jìn)行了前處理，并進(jìn)行HPLC分析，得到了橘皮竹茹湯基準(zhǔn)煎劑中多糖部位的指紋圖譜，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合溶液的HP

7、LC圖進(jìn)行比較，對指紋圖譜全部9個特征峰進(jìn)行指認(rèn)。明確了橘皮竹茹湯多糖部位的單糖組成。本方法能夠用來表征橘皮竹茹湯多糖部位物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，也是對橘皮竹茹湯中等極性部位指紋圖譜的有效補(bǔ)充。
　　為進(jìn)一步完善橘皮竹茹湯的質(zhì)量表征方法，參考《中國藥典》2010版后選取部分橘皮竹茹湯處方單味藥中有專屬性的活性相關(guān)成分為指標(biāo)成分，有橙皮苷、甘草酸、人參皂苷Rb1、6-姜辣素。對橘皮竹茹湯總方凍干粉分別采用不同的適當(dāng)方法進(jìn)行前處理后，借助HP

8、LC技術(shù)，建立了不同方法，從而對橘皮竹茹湯各指標(biāo)成分含量進(jìn)行測定，同時對各方法進(jìn)行了方法學(xué)確證實驗，結(jié)果表明這些方法可靠、適用。
　　為保證基準(zhǔn)湯劑研究用樣品具有代表性，各單味藥均由企業(yè)提供10批，且全部采用出自道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)的藥材，每種藥材2-3個產(chǎn)地，每個產(chǎn)地至少3批，隨機(jī)組合，制備10批研究用湯劑并用干膏率、指標(biāo)成分的含量測定及轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜相似度來表征關(guān)鍵質(zhì)量屬性，為其標(biāo)準(zhǔn)顆粒研發(fā)過程中工藝的研究提供參考依據(jù)。

9、　　除以上工作外，作者還完成了部分甘草瀉心湯化學(xué)成分表征的工作。甘草瀉心湯出自《傷寒論》，由甘草、半夏、黃芩、黃連、人參、干姜、大棗七味中藥組成。作者建立了該湯劑中甘草苷、黃芩苷和人參皂苷Rb1的含量測定方法，對其進(jìn)行了方法學(xué)確證，并完成了不同批次甘草瀉心湯中上述三種成分轉(zhuǎn)移率的計算。
　　本文首次建立了遵循原方、原劑量、原煎煮方法的橘皮竹茹湯基準(zhǔn)湯劑的制備方法和橘皮竹茹湯中等極性部位的指紋圖譜，結(jié)合實驗室已有的成熟技術(shù)建立了橘皮

10、竹茹湯多糖部位指紋圖譜，較好地表征了橘皮竹茹湯的物質(zhì)基礎(chǔ)；為測定橘皮竹茹湯中各指標(biāo)成分含量，建立了不同方法，并完成方法學(xué)確證研究；制備并測定了十批不同產(chǎn)地藥材隨機(jī)組合的基準(zhǔn)煎劑樣品的出膏率、指紋圖譜相似度和指標(biāo)成分含量，并計算指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率。同時，建立了甘草瀉心湯中部分指標(biāo)成分的含量測定方法，對其進(jìn)行了方法學(xué)確證，并完成了不同批次甘草瀉心湯中指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率的計算。該研究結(jié)果可作為工藝研究評價標(biāo)準(zhǔn)，全程指導(dǎo)工藝研究，確保標(biāo)準(zhǔn)顆粒與傳統(tǒng)湯劑