雌二醇對Aβ25-35誘導(dǎo)海馬新生神經(jīng)元損害的保護作用及其分子機制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(Beta-amyloid protein，Aβ)的過度積累，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、認知功能障礙，是阿爾茨海默病的主要病因。然而，我們對其神經(jīng)毒性機制的認識是非常有限的。最近的研究表明，無論在AD模型還是細胞培養(yǎng)方面，均提示Aβ結(jié)合受體介導(dǎo)了其主要的神經(jīng)毒性作用。
　　第一部分 雌二醇對Aβ25-35誘導(dǎo)海馬新生神經(jīng)元損害的保護作用

2、>　　目的:
　　本研究利用Aβ25-35側(cè)腦室內(nèi)注射方法建立阿爾茨海默病(AD)模型小鼠，并給予雌二醇(E2)干預(yù)。采用Morris水迷宮檢測小鼠的空間認知及學(xué)習(xí)記憶能力;利用免疫組化法檢測BrdU、DCX陽性神經(jīng)元;利用海馬腦片場電位記錄檢測EPSPs及LTP幅值。探討雌二醇對Aβ25-35誘導(dǎo)AD小鼠空間認知及學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用;探討Aβ25-35對小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)元存活、EPSPs及LTP幅值的影響;探討雌二醇對

3、Aβ25-35損害的海馬新生神經(jīng)元的保護作用及對EPSPs及LTP幅值的影響。
　　方法:
　　1.阿爾茨海默病動物模型的制備:小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35(3nmol/3μl)，制備Aβ誘導(dǎo)AD模型，對照組注射等量生理鹽水。
　　2.腦片的制備:小鼠用乙醚深麻醉后斷頭，迅速取出腦。將振動切片機放置在冰冷的切片溶液中，以冠狀位切成厚度為400μm的腦片。
　　3.長期雌二醇(E2)干預(yù)分組:小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ

4、25-35(3nmol/3μl)，制備Aβ誘導(dǎo)AD模型，對照組注射等量生理鹽水，再腹腔注射BrdU，50mg/kg，間隔6小時，連續(xù)給藥3次。BrdU注射后第6-28天，在小鼠皮下注射雌二醇。對照組按BrdU注射后第14(n=8)、21(n=8)、28(n=14)天分為3個亞組;模型組按BrdU注射后第14(n=8)、21(n=8)、28(n=14)天分為3個亞組;長期E2治療+對照組（皮下注射E2，10μg/day，n=8）;長期E2

5、治療+模型組（皮下注射E2，10μg/day，n=14）。
　　4.短期雌二醇(E2)干預(yù)分組:小鼠在BrdU腹腔注射后第25天側(cè)腦室注射Aβ25-35建立模型，對照組注射等量生理鹽水，然后給予3天雌二醇皮下注射。對照組(n=8);模型組(n=14);短期E2治療+對照組(3天E2皮下注射，10μg/day,n=8);短期E2治療+模型組（3天E2皮下注射，10μg/day，n=14）。
　　5.AD小鼠造模后第6-28天給

6、予雌二醇治療，對照組注射等量生理鹽水，采用Morris水迷宮檢測小鼠的空間認知能力及學(xué)習(xí)記憶功能。對照組(n=8);模型組(n=8); E2治療+對照組（E2皮下注射，10μg/day，n=8）; E2治療+模型組（皮下注射E2，1、5、10、15、20μg/day，n=40）。
　　6.BrdU免疫染色:在分裂細胞的DNA合成期，BrdU作為脫氧胸腺嘧啶類似物，摻入DNA單鏈中，用免疫組化法檢測BrdU陽性細胞，即可標記新生的細

7、胞。
　　結(jié)果:
　　1.E2改善了AD小鼠空間認知能力及學(xué)習(xí)記憶功能(P＜0.01)，10μg/day E2皮下注射，具有明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　2.BrdU染色表明，在BrdU后注射第14天、21天、28天，與對照組相比，Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型組小鼠第21天和28天的BrdU陽性細胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01），而第14天的BrdU陽性細胞數(shù)，兩組之間沒有明顯差異（P＞0.05）。
　　3.DCX染色檢

8、測結(jié)果表明，DCX的表達在第二周達到峰值，與對照組相比，Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型組小鼠DCX陽性細胞內(nèi)突觸密度明顯下降（P＜0.01）。
　　4.與對照組相比，Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型組小鼠海馬齒狀回區(qū)域的EPSP斜率降低（P＜0.05）。高頻刺激激發(fā)對照組小鼠海馬齒狀回穩(wěn)定增強的EPSP斜率，卻不能激發(fā)Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型組小鼠海馬齒狀回中的長時程增強效應(yīng)。
　　5.長期雌二醇注射輕度增加對照組BrdU陽性細胞數(shù)

9、（P＞0.05），而Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型組BrdU陽性細胞數(shù)增加更顯著（P＜0.01）。并且明顯提高AD模型組小鼠的EPSP斜率(P＜0.05)，增強AD模型組小鼠的長時程增強效應(yīng)。
　　6.短期雌二醇治療能夠輕度增加對照組和AD模型組小鼠第28天BrdU陽性細胞數(shù)目，但對照組與雌二醇治療的對照組小鼠之間、AD模型組與雌二醇治療的AD模型組小鼠之間，BrdU陽性細胞數(shù)差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。短期雌二醇治療雖然提高

10、了EPSP斜率(P＜0.05)，卻未能激發(fā)AD模型小鼠的長時程增強效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.雌二醇治療可以改善Aβ25-35誘導(dǎo)AD小鼠的空間認知及學(xué)習(xí)記憶能力。
　　2.Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型小鼠損害海馬齒狀回新生神經(jīng)元的存活和新生神經(jīng)細胞突觸的生長。
　　3.Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型小鼠抑制海馬齒狀回中長時程增強誘導(dǎo)。
　　4.長期雌二醇治療能改善Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型小鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)

11、元存活及長時程增強誘導(dǎo)，而短期雌二醇注射無明顯的改善作用。
　　5.雌二醇對Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型小鼠損害的海馬齒狀回LTP誘導(dǎo)效應(yīng)的改善可能依賴于其對新生神經(jīng)元的保護作用。
　　第二部分 雌二醇通過調(diào)控MAPKs、AKT通路抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞凋亡
　　目的:
　　體外培養(yǎng)大鼠起源的海馬神經(jīng)元細胞系HT22，體外構(gòu)建Aβ25-35細胞損傷模型，檢測Aβ25-35體外誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性及分子機制;評

12、價E2在體外拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的效果和分子機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)HT22細胞系，高糖DMEM培養(yǎng)基添加10％胎牛血清，1％雙抗，37℃，5％二氧化碳，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定指數(shù)增長時用于以下實驗。
　　2.體外模型構(gòu)建:HT22細胞以5000細胞/孔接種96孔板，37℃，5％二氧化碳，預(yù)培養(yǎng)24 h待細胞貼壁。隨機分為4個組:對照組、Aβ25-35組、E2組、E2+ Aβ25-35

13、組;Aβ25-35組又分4個亞組（分別加入Aβ25-355、10、20、40μM），E2組又分3個亞組（分別加入E20.01、0.1、1.0μM）。Aβ25-35組分別加入5μM、10μM、20μM、40μM的Aβ25-35處理24 h;E2組分別加入0.01μM、0.1μM、1.0μM E2處理24 h;E2+Aβ25-35組，E2(1.0μM)提前預(yù)處理HT22細胞1h后，加入Aβ25-35(10μM)繼續(xù)處理24小時。
　　

14、3.MTT檢測細胞活性:藥物處理結(jié)束后，MTT方法檢測細胞成活率，以正常對照組細胞活性為100％，計算藥物處理組的細胞活性百分比。
　　4.細胞形貌的改善:相差顯微鏡觀察HT22細胞細胞形貌的改變。主要觀測指標為:細胞數(shù)量、細胞形狀、細胞與細胞之間的連接等。
　　5.TUNEL-DAPI雙染檢測細胞凋亡:采用TUNEL-DAPI雙染檢測神經(jīng)元細胞凋亡。
　　6.Western blotting檢測信號通路蛋白的表達:W

15、estern blotting檢測MAPKs(p38、JNK、ERK)和PI3K/AKT信號通路的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果表明:Aβ25-35在體外處理HT22細胞，可劑量依賴性的抑制HT22細胞生長(P＜0.01)，E2在24 h內(nèi)無明顯細胞毒性(P＞0.05);然而，E2預(yù)處理HT22細胞，可顯著減弱Aβ25-35誘導(dǎo)的細胞活性的降低(P＜0.01)。
　　2.TUNEL-DAPI雙染結(jié)果表明:A

16、β25-35處理可顯著誘導(dǎo)HT22細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細胞的增多(P＜0.01);然而，E2預(yù)處理可顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細胞的減少(P＜0.01)。
　　3.機制研究表明:Aβ25-35處理可顯著影響MAPKs通路和PI3K/AKT通路蛋白的表達，表現(xiàn)為磷酸化JNK、磷酸化p38表達的激活(P＜0.01)，磷酸化ERK蛋白的失活以及磷酸化AKT蛋白的失活(P＜0.01);然而

17、，E2預(yù)處理顯著抑制了Aβ25-35誘導(dǎo)的磷酸化JNK、磷酸化p38表達的激活(P＜0.01)，抑制了磷酸化ERK蛋白的失活以及磷酸化AKT蛋白的失活(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.Aβ25-35在體外可劑量依賴性的抑制HT22細胞細胞生長，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)元毒性;E2在體外可減弱Aβ25-35對HT22的細胞毒性。
　　2.Aβ25-35處理顯著誘導(dǎo)了神經(jīng)元細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細胞的增多;E2處理顯