MiR-429與卵巢上皮癌耐藥相關(guān)性的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一章 miRNA與卵巢上皮癌耐藥研究進(jìn)展
　　卵巢上皮癌是在全世界婦女中致死率第五位的最常見的婦科惡性腫瘤。手術(shù)及以紫杉醇和順鉑為主的化療是治療卵巢上皮癌重要手段之一，但多藥耐藥的產(chǎn)生又是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵因素。因此，了解化療耐藥產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)于提高治療效果至關(guān)重要。卵巢上皮癌多藥耐藥與多種因素有關(guān)，本章節(jié)就miRNA與卵巢上皮癌多藥耐藥機(jī)制進(jìn)行綜述。
　　第二章 miRNA對(duì)卵巢

2、上皮癌多藥耐藥相關(guān)的生物信息學(xué)分析
　　1.研究目的:
　　基于表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)手段挖掘與卵巢癌上皮耐藥調(diào)控相關(guān)的潛在miRNAs和基因。
　　2.研究方法:
　　在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與卵巢癌耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GS54665和mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE33482，GSE28646，GSE15372，并利用GEO2R工具進(jìn)行差異分析和

3、篩選，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其獲得的部分基因在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP和A2780/DDP及其親本細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)通路富集、生物學(xué)過(guò)程注釋、文本挖掘、蛋白互作及miRNA-mRNA互作等綜合生物信息學(xué)方法研究差異表達(dá)miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調(diào)控的相關(guān)性。
　　3.研究結(jié)果:
　　3.1 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了符合標(biāo)準(zhǔn)的與卵巢癌耐藥相關(guān)的1組miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和3組mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，獲得了在耐藥

4、細(xì)胞中差異表達(dá)的9個(gè)miRNAs和在三組芯片耐藥細(xì)胞中均差異表達(dá)的38個(gè)基因，其中7個(gè)差異表達(dá)基因在三組芯片中趨勢(shì)完全一致。
　　3.2 9個(gè)miRNAs的通路富集獲得了Focal adhesion、PI3K-Akt signalingpathway、ErbB signaling pathway，MAPK signaling pathway等多個(gè)與卵巢癌耐藥相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)，而生物學(xué)過(guò)程注釋和通路富集表明上述38個(gè)基因與細(xì)胞因子

5、-細(xì)胞因子受體作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)通路，細(xì)胞黏附及免疫調(diào)節(jié)等卵巢癌耐藥生物學(xué)過(guò)程顯著相關(guān)
　　3.3 miRNA-mRNA互作分析表明9個(gè)miRNAs與38個(gè)基因中的大多數(shù)成員存在靶向調(diào)控關(guān)系，從而從整體上說(shuō)明本研究中篩選的差異表達(dá)miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調(diào)控的相關(guān)性。
　　4.研究結(jié)論:
　　4.1 通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)分析，篩選出9個(gè)miRNA及38個(gè)

6、mRNA與卵巢癌耐藥有關(guān)，其中7個(gè)mRNA在所有芯片結(jié)果中表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　4.2 EPHA7和PI15為差異表達(dá)miRNA-141的潛在靶基因，且它們?cè)诒磉_(dá)水平上呈負(fù)相關(guān)，可能共同參與卵巢癌耐藥，是卵巢癌靶向治療的潛在靶標(biāo)
　　第三章 卵巢上皮癌多藥耐藥相關(guān)lncRNA表達(dá)譜分析及與miRNA相關(guān)的ceRNA篩選
　　化療是晚期卵巢上皮癌的首選治療方法，但是耐藥的產(chǎn)生是妨礙化療長(zhǎng)期有效的一個(gè)重要的因素。近年來(lái)，人們

7、把研究的目光投向了長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，通常具有polyA尾，廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。由于缺少“開放閱讀框架”，lncRNA不編碼蛋白，其可在表觀遺傳學(xué)，轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。但是現(xiàn)在與耐藥相關(guān)的lncRNA及與miRNA存在ceRNA調(diào)控的lncRNA還鮮有報(bào)道。
　　1.

8、研究目的:
　　對(duì)卵巢癌多藥耐藥相關(guān)lncRNA和基因進(jìn)行表達(dá)譜分析，初步得到卵巢癌多藥耐藥相關(guān)lncRNA及基因，為闡明卵巢癌耐藥機(jī)制和獲得具有克服耐藥潛能的靶分子打下基礎(chǔ)。
　　2.研究方法:
　　2.1 通過(guò)lncRNA芯片對(duì)卵巢癌上皮癌耐藥組織標(biāo)本5例及敏感組織各5例進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，同時(shí)分析差異表達(dá)的mRNA，找到在耐藥細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA;
　　2.2 對(duì)差異表達(dá)的lncRNA采用P

9、earson相關(guān)分析進(jìn)行共表達(dá)基因分析、然后利用超幾何累積分布函數(shù)(Hypergeometric cumulative distributionfunction)按FDR＜0.01，P＜0.05，對(duì)編碼基因的進(jìn)行功能注釋。
　　2.3 通過(guò)ceRNA_score原理進(jìn)行ceRNA分析，并通過(guò)調(diào)控的mRNA進(jìn)行GO、KEGG功能注釋;并篩選與miR-200家族相關(guān)的ceRNA。
　　3.研究結(jié)果:
　　3.1 根據(jù)差異表

10、達(dá)的標(biāo)準(zhǔn):Fold change值≥2.0且p≤0.05，耐藥組和對(duì)敏感組相比，有738個(gè)lncRNAs表達(dá)有差異，其中上調(diào)311個(gè)，下調(diào)427個(gè)，其中NONHSAT076042(Fold change:8.95)是上調(diào)倍數(shù)最大的lncRNA，TCONS_12_00021133(Fold change:7.29)是下調(diào)倍數(shù)最大的lncRNA;同時(shí)檢測(cè)到有983個(gè)mRNAs表達(dá)有差異，其中上調(diào)678個(gè)，下調(diào)308個(gè)，其中SFRP2(Fol

11、d change:28.48)是上調(diào)倍數(shù)最大的mRNA，LDLRAD1(Foldchange:16.44)是下調(diào)倍數(shù)最大的mRNA。
　　3.2 采用Pearson相關(guān)分析，按照LncRNAs與mRNAs表達(dá)值的相關(guān)系數(shù)(Correlation)＞0.7，p＜0.05對(duì)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行共表達(dá)基因分析，選出上調(diào)、下調(diào)lncRNA各top300，然后分別進(jìn)行功能富集，篩選出預(yù)測(cè)到的功能terms top500，結(jié)果顯示上調(diào)表達(dá)

12、的lncRNA主要與白細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)、DNA包裝、細(xì)胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(guān)(p＜0.05);下調(diào)表達(dá)的lncRNA主要細(xì)胞外基質(zhì)組成、細(xì)胞骨架、DNA包裝、細(xì)胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(guān)(p＜0.05)。
　　3.3 通過(guò)ceRNA分析，得到25個(gè)可以作為ceRNA的lncRNA，一共是335個(gè)ceRNA關(guān)系對(duì)，其中，我們也發(fā)現(xiàn)有5個(gè)lncRNA可以作為miR-200家族相關(guān)的ceRNA，形成ceRNA調(diào)控

13、關(guān)系對(duì)13個(gè)。參與ceRNA調(diào)控的lncRNA主要參與的生物學(xué)過(guò)程及KEGG通路有:細(xì)胞黏附、NF-kappaB負(fù)調(diào)控、間質(zhì)細(xì)胞的增殖、凋亡、Ras信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等。
　　4.研究結(jié)論:
　　4.1 通過(guò)分析卵巢上皮癌耐藥組織和敏感的lncRNA和mRNA表達(dá)譜特征我們獲得了大量差異表達(dá)的lncRNA及mRNA，為我們進(jìn)行卵巢上皮癌多藥耐藥機(jī)制研究提供了很好的資源
　　4.2 與卵巢上皮癌耐藥有關(guān)的lncR

14、NA可能是通過(guò)cis調(diào)控相鄰的基因、trans調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子作用于靶基因，或通過(guò)ceRNA調(diào)控miRNA，或者通過(guò)參與和調(diào)控多種信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程參與卵巢上皮癌耐藥。
　　4.3 5個(gè)lncRNA(NONHSAT059750、NONHSAT129265、NONHSAT128169、ENST00000529924、TCONS_12_00003421)與miR-429及其靶基因構(gòu)成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　第四章 miR-42

15、9對(duì)卵巢上皮性癌SKOV3/DDP細(xì)胞的生物學(xué)功能的體外研究
　　1.研究目的:
　　卵巢上皮癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤，耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療過(guò)程中最嚴(yán)重的問(wèn)題之一。腫瘤耐藥與多種因素有關(guān)，miRNA可能與耐藥密切相關(guān)。miR-429屬于miR-200家族，miR-200家族與多種腫瘤耐藥有關(guān)。本章我們將通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-429對(duì)卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　2.研究方法:
　

16、　我們利用慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建穩(wěn)定上調(diào)miR-429的EOC細(xì)胞模型，QRT-PCR檢測(cè)miR-429的表達(dá)水平，CCK8法檢測(cè)IC50、生長(zhǎng)曲線和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用WB檢測(cè)miR-429對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響。
　　3.研究結(jié)果:
　　3.1 與親本細(xì)胞SKOV3相比，miR-429在耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP中下調(diào)表達(dá)，卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP對(duì)化療藥物順鉑的IC50約

17、為親本細(xì)胞的2.5倍。
　　3.2 在SKOV3/DDP中轉(zhuǎn)染了LV-miR-429過(guò)表達(dá)病毒，miR-429的表達(dá)量較SKOV3/DDP及LV-miR-NC組，明顯升高（P＜0.05）。過(guò)表達(dá)miR-429后，SKOV3/DDP對(duì)順鉑的IC50明顯下降（P＜0.05）。
　　3.3 CCK8增殖結(jié)果:轉(zhuǎn)染了miR-429的SKOV3/DDP細(xì)胞組的生長(zhǎng)速度從第48h開始較miR-NC組、空白對(duì)照組的細(xì)胞降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意