雞白痢沙門氏菌常規(guī)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的危害養(yǎng)禽業(yè)的細(xì)菌病之一，嚴(yán)重影響著我國禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并且被列為國家規(guī)定凈化的細(xì)菌病。目前，最有效的防控措施是加強(qiáng)對雞群的檢疫、及時(shí)淘汰感染雞只，逐步達(dá)到凈化雞群的目的。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法對于雞白痢的凈化工作有著重要意義。
　　本研究中，通過對GenBank登錄的菌株號為ATCC9120的雞白痢沙門氏菌全基因組進(jìn)行全面生物信息學(xué)分析，與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他菌屬的基因組比較，篩選出了

2、雞白痢沙門氏菌基因組中的一段基因號為SEEP9120_017695的保守序列，該基因?yàn)殡u自痢沙門氏菌的特有基因，因此確定其為檢測雞白痢沙門氏菌的靶基因。根據(jù)選出的靶點(diǎn)基因設(shè)計(jì)了11對候選引物，使用33株沙門氏菌和11株非沙門氏菌以PCR方法分別驗(yàn)證各對引物的特異性，最終篩選出了一對特異性最好且擴(kuò)增條帶大小(219 bp)適合進(jìn)行熒光定量PCR的引物，經(jīng)PCR條件優(yōu)化后建立了一種常規(guī)PCR檢測方法。對所建立方法的靈敏度進(jìn)行檢驗(yàn)，其檢測雞白

3、痢沙門氏菌基因組時(shí)，靈敏度可達(dá)2.13 pg/μL;檢測細(xì)菌純培養(yǎng)物時(shí)靈敏度為2.1×104 cfu/mL。以該方法對人工污染雞白痢沙門氏菌的雞糞、雞蛋和雞肉進(jìn)行檢測，對于輕度污染(13 cfu/10g樣品)的樣品，只需要對樣品增菌培養(yǎng)6～8小時(shí)便可檢出;增菌培養(yǎng)2h便可檢測嚴(yán)重污染（1.3×107 cfu/10g樣品）的樣品。但是在檢測雞蛋樣品時(shí)需適當(dāng)增加1～2小時(shí)的增菌時(shí)間便可有效檢出陽性樣品。
　　根據(jù)常規(guī)PCR方法的反應(yīng)條

4、件，建立了SYBR熒光定量PCR方法。依據(jù)特異性評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中44個(gè)菌株的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，分析可知該方法檢測雞白痢沙門氏菌時(shí)的特異性好。建立的SYBR熒光定量PCR方法檢測雞白痢沙門氏菌基因組的靈敏度為34 fg/μL。使用雞白痢沙門氏菌分別污染雞糞、雞蛋、雞肉，建立人工污染樣品，同時(shí)使用本研究建立的SYBR熒光定量PCR方法和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌分離鑒定的方法對污染樣品進(jìn)行檢測，評價(jià)本方法的檢測效果。當(dāng)雞白痢沙門氏菌的初始污染量低至2 cfu

5、/10 g雞糞或雞肉時(shí)，經(jīng)過6h對樣品的振蕩培養(yǎng)，熒光定量PCR方法陽性檢出率為24/27(88.9％)，與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的符合率為100％;當(dāng)以2 cfu/10 mL的初始接種量污染雞蛋時(shí)，6h后熒光定量PCR方法的陽性檢出率為21/27(77.8％)，與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的符合率為91.7％。
　　本研究篩選到一個(gè)雞白痢沙門氏菌特有的基因作為檢測用的靶基因，并以此建立了常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，兩種方法在實(shí)際檢測中各有優(yōu)