應(yīng)用DNA-納米金探針和基因芯片檢測基因突變的研究.pdf

1、本文利用納米技術(shù)與基因芯片技術(shù),在制備寡核苷酸及蛋白兩種生物分子標(biāo)記納米金基礎(chǔ)上,結(jié)合分子生物學(xué)和免疫學(xué)的方法,建立高靈敏度的核酸檢測方法,為分子生物學(xué)領(lǐng)域提供了快速、簡便、高靈敏度的檢測基因突變的新方法。我們采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備納米金?；诩{米金粒子與巰基修飾的寡核苷酸共價(jià)結(jié)合、與蛋白分子通過吸附作用結(jié)合,建立不同生物分子標(biāo)記納米金探針的制備方法,并構(gòu)建三種探針:寡核苷酸納米金探針、堿性磷酸酶納米金探針和熒光納米金探針。通過

2、透射電子顯微鏡（TEM）、紫外吸收光譜對(duì)納米金及納米金探針進(jìn)行形貌觀察和表征分析;熒光標(biāo)記法檢測納米金顆粒表面探針覆蓋率,并結(jié)合納米金探針的濃度,檢測納米金表面探針標(biāo)記量。三種不同的納米金探針分別與靶核酸及基因芯片進(jìn)行雜交,在芯片上形成“三明治”復(fù)合結(jié)構(gòu)。分別采用銀染、膜顯色及測定熒光三種方法檢測基因芯片上的雜交結(jié)果,并通過檢測信號(hào)的強(qiáng)度確定待測核酸的存在,建立了檢測核酸的基因芯片銀染法,基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法和基因芯片熒光檢測法。結(jié)果顯

3、示,透射電子電鏡TEM觀察制備的納米金粒子粒徑,大小均勻,直徑為13nm;制備的納米金探針形態(tài)完好,分散均勻。熒光標(biāo)記法檢測出納米金顆粒表面探針標(biāo)記量,每個(gè)納米金表面大約標(biāo)記82～83個(gè)探針分子。納米金探針與基因芯片直接雜交并銀染檢測靶核酸,可檢測最低濃度為10-10M的目標(biāo)核酸分子?；蛐酒瑹晒鈾z測方法通過納米金表面信號(hào)探針與檢測探針的比例（5:1）放大檢測信號(hào),并將基因芯片上不易測量的雜交結(jié)果轉(zhuǎn)為易測的熒光信號(hào),可檢測最低濃度為10

4、-12 M的目標(biāo)核酸分子?；蛐酒まD(zhuǎn)印檢測法不需要專門的掃描儀器掃描結(jié)果信號(hào),其通過酶催化底物顯色,即可在尼龍膜上呈現(xiàn)肉眼可見的顏色斑點(diǎn),同時(shí)也將基因芯片上的雜交結(jié)果轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,目前,該方法檢測靈敏度為10-8 M目標(biāo)核酸分子。研究表明,運(yùn)用納米金探針結(jié)合基因芯片技術(shù)提出的三種核酸檢測方法,具有操作簡單,時(shí)間短,特異性好,靈敏度高,節(jié)約核酸探針用量等特點(diǎn);通過運(yùn)用納米金探針不僅利于雜交反應(yīng),而且通過標(biāo)記不同的標(biāo)記物,將基因芯片上不