LPS與富含色氨酸抗菌肽的相互作用及其對(duì)抗菌活性的影響.pdf

1、革蘭氏陰性菌所引發(fā)的敗血性休克已對(duì)人類(lèi)健康造成了極大的威脅，其細(xì)胞壁主要成分脂多糖(LPS)是誘發(fā)敗血性休克的主要原因。本文研究了LPS對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽的抗菌活性的影響，以及LPS與抗菌肽之間的相互作用。
　　抗菌肽L-K6是從中國(guó)林蛙（Rana chensinensis）皮膚分泌物分離純化而來(lái)的天然抗菌肽temporin-1CEb的衍生肽，實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)L-K6進(jìn)行了改造，通過(guò)對(duì)位置1、4、5、11和12的亮氨酸和異亮氨酸進(jìn)行色氨酸

2、（Trp）替換，合成了7種含有Trp的新型改造肽，這7種抗菌肽都含有6個(gè)凈正電荷，對(duì)大腸桿菌等2種革蘭氏陰性菌有較好的抗菌活性，對(duì)肺炎克雷伯菌等3種菌活性較差。本論文首先研究了LPS對(duì)7種含Trp抗菌肽的抗菌活性的影響，結(jié)果表明:LPS不同程度地抑制7種抗菌肽的抗菌活性，并且隨LPS的濃度的增大，抗菌活性越小，尤其是L11W、L12W的抗菌活性受LPS的影響最大。這種影響與LPS抑制7種含Trp抗菌肽的膜作用活性有直接關(guān)系。膜去極化實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果顯示抗菌肽對(duì)大腸桿菌原生質(zhì)體的細(xì)胞膜去極化作用很強(qiáng)，與沒(méi)有LPS外膜的革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的去極化作用效果相似，但對(duì)完整的大腸桿菌的作用明顯降低。LPS對(duì)7種抗菌肽的膜去極化作用效果不同，對(duì)L12W的影響最大，L12W對(duì)去掉LPS細(xì)胞外膜的大腸桿菌原生質(zhì)體去極化作用最強(qiáng)，對(duì)其它肽的影響不大，I1WL5W的去極化作用不受LPS的影響。模擬細(xì)菌外膜的脂質(zhì)體鈣黃綠素的釋放的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證明了LPS降低了7種含有Trp的抗菌肽對(duì)膜

4、通透性的作用，結(jié)果與去極化效果相似。通過(guò)激光共聚焦的觀察發(fā)現(xiàn)，7種含有Trp的抗菌肽能夠破壞大腸桿菌細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞而殺死細(xì)菌，這是因?yàn)門(mén)rp殘基有高程度的疏水性，容易插入細(xì)菌膜內(nèi)。
　　7種含有Trp抗菌肽均帶有正電荷，是陽(yáng)離子抗菌肽，而LPS帶有負(fù)電荷，本論文研究了這些抗菌肽與LPS之間的相互作用。采用CD光譜實(shí)驗(yàn)，等溫滴定量熱法(ITC)，Zeta電勢(shì)，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和FITC-LPS的解聚實(shí)驗(yàn)，探討了7種含有Trp抗

5、菌肽通過(guò)靜電作用與LPS結(jié)合，滲透細(xì)菌外膜，最終破壞細(xì)胞質(zhì)膜的作用機(jī)制。CD光譜顯示，7種抗菌肽在SP緩沖溶液中均呈無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，但在LPS溶液中，四種抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)規(guī)則的α-螺旋結(jié)構(gòu)，說(shuō)明LPS可以誘導(dǎo)抗菌肽形成規(guī)則結(jié)構(gòu)。ITC實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)熱力學(xué)參數(shù)的分析顯示37℃下抗菌肽與LPS的結(jié)合是一個(gè)放熱的過(guò)程，表明抗菌肽的正電荷可以通過(guò)靜電作用與LPS的負(fù)電荷結(jié)合。Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)顯示LPS與7種抗菌肽發(fā)生電荷補(bǔ)償現(xiàn)象，也說(shuō)明抗菌肽能

6、與LPS相互結(jié)合。DLS和FITC-LPS解聚實(shí)驗(yàn)顯示抗菌肽與LPS結(jié)合后，能解聚LPS聚集體，使聚合狀態(tài)的LPS分子粒徑變小，有利于抗菌肽的滲入。7種抗菌肽的結(jié)合LPS及解聚LPS的效果不同，I1WL5W解聚效果最好，完全消除了大分子的LPS聚集體。
　　總之，7種含有Trp的抗菌肽的抗菌活性不同程度的受LPS的影響，細(xì)菌外膜中的LPS是抗菌肽的第一個(gè)滲透屏障，隨著肽與LPS的相互作用，部分抗菌肽得以穿透外膜到達(dá)內(nèi)膜，發(fā)揮殺菌作